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8.2 : Techniques de fractionnement et de chromatographie - Biologie

8.2 : Techniques de fractionnement et de chromatographie - Biologie



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Le fractionnement des échantillons, comme son nom l'indique, est un processus de séparation des composants ou des fractions du lysat. En utilisant une centrifugation à basse vitesse, on peut éliminer les débris cellulaires, laissant un surnageant contenant le contenu de la cellule. En utilisant des vitesses de centrifugation de plus en plus élevées (et les forces g qui en résultent), il est possible de séparer différents composants cellulaires, comme les noyaux, les mitochondries, etc., du cytoplasme. Ceux-ci peuvent ensuite être lysés séparément pour libérer des molécules spécifiques au compartiment cellulaire particulier. La fraction soluble de tout lysat peut ensuite être encore séparée en ses constituants en utilisant diverses méthodes.

Chromatographie sur colonne

Une méthode puissante utilisée à cette fin est la chromatographie. Nous allons considérer plusieurs approches chromatographiques. La chromatographie est utilisée pour séparer les composants d'un mélange en fonction des différences de taille, de charge ou d'autres caractéristiques. Au cours de la chromatographie, la phase mobile (tampon ou autre solvant) se déplace à travers la phase stationnaire (généralement une matrice solide) transportant les composants du mélange. La séparation des composants est obtenue, car les différents composants se déplacent à des vitesses différentes, pour des raisons qui varient en fonction du type de chromatographie utilisé. Nous allons considérer plusieurs types de chromatographie pour illustrer ce processus.

  • Chromatographie échangeuse d'ions
  • Chromatographie d'exclusion sur gel
  • Chromatographie d'affinité
  • HPLC

Ces variations de chromatographie sont réalisées avec la phase stationnaire contenue dans des colonnes (Figure (PageIndex{1})). Ce sont des tubes contenant la phase stationnaire (appelée aussi « support » ou phase solide).

Les supports sont composés de minuscules billes suspendues dans du tampon (Figure (PageIndex{3})) et sont conçus pour exploiter les différences chimiques ou de taille des composants des échantillons et ainsi fournir un moyen de séparation. Les colonnes sont « garnies » ou remplies du support, et un tampon ou solvant transporte le mélange de composés à séparer à travers le support. Les molécules de l'échantillon interagissent différemment avec le support et par conséquent le traversent à des vitesses différentes, permettant ainsi la séparation.

Chromatographie échangeuse d'ions

En chromatographie échangeuse d'ions, le support est constitué de minuscules billes auxquelles sont attachés des produits chimiques possédant une charge. Avant utilisation, les billes sont équilibrées dans une solution contenant un contre-ion approprié à la molécule chargée sur la bille. La figure (PageIndex{5}) montre l'unité répétitive du polystyrolsulfonate, un composé utilisé comme résine échangeuse de cations. Comme vous pouvez le voir, cette molécule est chargée négativement, et donc les billes seraient équilibrées dans un tampon contenant un ion chargé positivement, par exemple le sodium. Dans la suspension, le polystyrolsulfonate chargé négativement est incapable de quitter les billes, en raison de sa fixation covalente, mais les contre-ions (sodium) peuvent être « échangés » contre des molécules de même charge.

des échanges

Ainsi, une colonne échangeuse de cations aura des contre-ions chargés positivement et des molécules chargées négativement attachées de manière covalente aux billes. Les composés chargés positivement d'un lysat cellulaire passé à travers la colonne s'échangeront avec les contre-ions et « colleront » aux composés chargés négativement attachés de manière covalente aux billes. Les molécules de l'échantillon qui sont neutres en charge ou chargées négativement passeront rapidement à travers la colonne. À ce stade, seules les molécules chargées positivement de l'échantillon d'origine seraient liées à la colonne. Ceux-ci peuvent ensuite être lavés ou élués en utilisant des tampons contenant des concentrations élevées de sel. Dans ces conditions, l'interaction entre les molécules chargées positivement et le polystyrosulfonate serait perturbée, permettant de récupérer les molécules liées à la colonne.

Échange d'anions

D'autre part, en chromatographie échangeuse d'anions, les produits chimiques attachés aux billes sont chargés positivement et les contre-ions sont chargés négativement (chlorure, par exemple). Les molécules chargées négativement dans le lysat cellulaire "colleront" et d'autres molécules passeront rapidement. Pour éliminer les molécules "collées" à une colonne, il suffit d'ajouter une forte concentration de contre-ions pour les libérer.

Les usages

Les résines échangeuses d'ions sont utiles pour séparer les biomolécules chargées des non chargées, ou chargées de manière opposée, en solution. Les résines ont une variété d'autres applications, y compris la purification et l'adoucissement de l'eau. La figure (PageIndex{5}) montre l'utilisation d'un polymère de polystyrolsulfonate pour éliminer le calcium pour l'adoucissement de l'eau.


Figure (PageIndex{5}): Élimination des ions calcium par un échangeur d'ions. Wikipédia

Chromatographie d'exclusion de taille

La chromatographie d'exclusion stérique (également appelée chromatographie d'exclusion moléculaire, chromatographie d'exclusion sur gel ou chromatographie de filtration sur gel) est une méthode de séparation à faible résolution qui utilise des billes contenant de minuscules « tunnels » qui ont chacun une ouverture précise. La taille de l'ouverture est appelée « limite d'exclusion », ce qui signifie que les molécules au-dessus d'un certain poids moléculaire ne pourront pas traverser les tunnels. Les molécules avec des tailles physiques supérieures à la limite d'exclusion n'entrent pas dans les tunnels et traversent la colonne relativement rapidement, dans les espaces extérieurs aux billes. Les molécules plus petites, qui peuvent entrer dans les tunnels, le font, et ont donc un chemin plus long qu'elles empruntent en passant à travers la colonne et éluent en dernier (Figure (PageIndex{6})).

La figure (PageIndex{7}) montre un profil d'un groupe de protéines séparées par chromatographie d'exclusion stérique en utilisant des billes avec une limite d'exclusion d'environ 30 000 Daltons. Les protéines d'un poids moléculaire de 30 000 ou plus s'éluent dans le volume vide (à gauche) tandis que les protéines plus petites s'éluent plus tard (au milieu et à droite).

Chromatographie d'affinité

La chromatographie d'affinité est une technique très puissante et sélective qui exploite les affinités de liaison des molécules d'échantillon (généralement des protéines) pour les molécules liées de manière covalente aux billes de support. Contrairement à la chromatographie échangeuse d'ions, où toutes les molécules d'une charge donnée se lieraient à la colonne, la chromatographie d'affinité exploite la liaison spécifique d'une protéine ou de protéines à un ligand immobilisé sur les billes de la colonne.

Par exemple, si l'on voulait séparer toutes les protéines d'un lysat cellulaire qui se lient à l'ATP des protéines qui ne se lient pas à l'ATP, on pourrait utiliser une colonne qui a de l'ATP attaché aux billes de support et faire passer l'échantillon à travers la colonne. Toutes les protéines qui se lient à l'ATP « colleront » à la colonne, tandis que celles qui ne se lient pas à l'ATP la traverseront rapidement. Les protéines liées peuvent ensuite être libérées de la colonne en ajoutant une solution d'ATP qui déplacera les protéines liées en entrant en compétition, pour les protéines, avec l'ATP attaché à la matrice de la colonne.

Marquage à l'histidine

Le marquage à l'histidine (His-tagging) est un type spécial de chromatographie d'affinité et constitue un outil puissant pour isoler une protéine recombinante à partir d'un lysat cellulaire. Le marquage His repose sur la modification de la région codante de l'ADN pour une protéine afin d'ajouter une série d'au moins six résidus histidine à l'extrémité amino ou carboxyle de la protéine codée. Ce "His-Tag" est utile pour purifier la protéine marquée car les chaînes latérales de l'histidine peuvent se lier aux ions nickel ou cobalt. La séparation des protéines marquées par His d'un lysat cellulaire est relativement facile (Figure (PageIndex{8})). Le passage du lysat cellulaire brut à travers une colonne avec du nickel ou du cobalt attaché aux billes permet aux protéines marquées par His de « coller ”, tandis que les protéines cellulaires restantes passent toutes rapidement à travers. Les protéines marquées His sont ensuite éluées par addition d'imidazole à la colonne. L'imidazole, qui ressemble à la chaîne latérale de l'histidine, entre en compétition avec les protéines marquées His et les déplace de la colonne. Bien que les protéines non marquées dans le lysat puissent également contenir de l'histidine dans leur séquence, elles ne se lieront pas à la colonne aussi fortement que la protéine marquée par His et seront donc déplacées à des concentrations d'imidazole inférieures à celles nécessaires pour éluer le His -protéine étiquetée. Étonnamment, de nombreuses protéines marquées par His semblent fonctionner normalement malgré les histidines ajoutées, mais si nécessaire, les étiquettes d'histidine peuvent être clivées de la protéine purifiée par traitement avec une protéase qui excise les histidines ajoutées, permettant la récupération de la protéine souhaitée avec son séquence native.


Figure (PageIndex{8}): Purification chromatographique d'affinité d'une protéine par marquage à l'histidine.Image d'Aleia Kim

HPLC

La chromatographie liquide à haute performance (HPLC) est un outil puissant pour séparer une variété de molécules en fonction de leurs polarités différentielles (Figure (PageIndex{9})). Une forme plus efficace de chromatographie sur colonne, elle utilise des colonnes avec des supports étroitement emballés et de très petites billes de sorte que le flux de solvants/tampons à travers les colonnes nécessite des pressions élevées. Les supports utilisés peuvent être polaires (séparation de phases normale) ou non polaires (séparation de phases inverse). Dans les séparations de phase normales, les molécules non polaires sont éluées en premier, suivies des composés plus polaires. Cet ordre est commuté en chromatographie en phase inverse. Des deux, la phase inverse est beaucoup plus couramment utilisée en raison des profils chromatographiques plus reproductibles (séparations) qu'elle produit généralement.


Figure (PageIndex{9}): HPLC : Pompes à gauche/Colonne au centre/Détecteur à droite. Wikipédia


Fractionnement d'un mélange de protéines complexes par chromatographie liquide tridimensionnelle virtuelle basée sur des étapes combinées de pH et de sel

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Ces cinq tests identifient les principaux composés chimiques biologiquement importants. Pour chaque test, prenez une petite quantité de la substance à tester et agitez-la dans de l'eau dans un tube à essai. Si l'échantillon est un morceau de nourriture, broyez-le avec de l'eau dans un pilon et un mortier pour briser les cellules et libérer le contenu des cellules. Beaucoup de ces composés sont insolubles, mais les tests fonctionnent tout aussi bien sur une suspension fine.

Amidon (test à l'iode) :

  • A environ 2 cm³ de la solution à tester, ajouter deux gouttes de solution d'iode/iodure de potassium.
  • Une couleur bleu-noir indique la présence d'amidon lorsqu'un complexe amidon-polyiodure se forme.
  • L'amidon n'est que légèrement soluble dans l'eau, mais le test fonctionne bien en suspension ou sous forme solide.

Sucres réducteurs (test de Benedict) :

  • Tous les monosaccharides et la plupart des disaccharides (à l'exception du saccharose) réduiront le sulfate de cuivre (II), produisant un précipité d'oxyde de cuivre (I) lors du chauffage, ils sont donc appelés sucres réducteurs.
  • Le réactif de Benedict est une solution aqueuse de sulfate de cuivre (II), de carbonate de sodium et de citrate de sodium.
  • A environ 2 cm³ de test, la solution ajoute une quantité égale de réactif de Benedict. Agiter et chauffer quelques minutes à 95°C au bain-marie.
  • Un précipité indique un sucre réducteur. La couleur et la densité du précipité donnent une indication de la quantité de sucre réducteur présent, ce test est donc semi-quantitatif.
  • La couleur bleu pâle d'origine signifie qu'il n'y a pas de sucre réducteur, un précipité vert signifie relativement peu de sucre, un précipité brun ou rouge signifie que progressivement plus de sucre est présent.

Sucres non réducteurs (test de Benedict) :

  • Le saccharose est appelé sucre non réducteur car il ne réduit pas le sulfate de cuivre, il n'y a donc pas de test direct pour le saccharose.
  • Cependant, s'il est d'abord hydrolysé (décomposé) en ses monosaccharides constitutifs (glucose et fructose), il donnera alors un test Benedict's positif.
  • Le saccharose est donc le seul sucre qui donnera un test de Benedict négatif avant l'hydrolyse et un test positif après. Testez d'abord un échantillon pour les sucres réducteurs, pour voir s'il y en a avant l'hydrolyse. Puis, à l'aide d'un échantillon séparé, faire bouillir la solution d'essai avec de l'acide chlorhydrique dilué pendant quelques minutes pour hydrolyser la liaison glycosidique. Neutralisez la solution en ajoutant doucement de petites quantités d'hydrogénocarbonate de sodium solide jusqu'à ce qu'elle cesse de pétiller, puis testez comme précédemment pour les sucres réducteurs.
  • Testez d'abord un échantillon pour les sucres réducteurs, pour voir s'il y en a avant l'hydrolyse. Puis, à l'aide d'un échantillon séparé, faire bouillir la solution d'essai avec de l'acide chlorhydrique dilué pendant quelques minutes pour hydrolyser la liaison glycosidique. Neutralisez la solution en ajoutant doucement de petites quantités d'hydrogénocarbonate de sodium solide jusqu'à ce qu'elle cesse de pétiller, puis testez comme précédemment pour les sucres réducteurs.

Lipides (test émulsion) :

  • Les lipides ne se dissolvent pas dans l'eau mais se dissolvent dans l'éthanol. Cette caractéristique est utilisée dans le test d'émulsion.
  • Ne commencez pas par dissoudre l'échantillon dans l'eau, mais agitez plutôt une partie des échantillons à tester avec environ 4 cm³ d'éthanol.
  • Décanter le liquide dans un tube à essai d'eau, en laissant toute substance non dissoute derrière.
  • S'il y a des lipides dissous dans l'éthanol, ils précipiteront dans l'eau, formant une émulsion blanche trouble.

Protéine (test au biuret) :

  • À environ 2 cm³ de solution à tester, ajoutez un volume égal de solution de biuret, sur le côté du tube à essai.
  • Un anneau bleu se forme à la surface de la solution, qui disparaît en secouant, et la solution devient lilas-violet, indiquant la protéine.
  • La couleur est due à un complexe entre les atomes d'azote dans la chaîne peptidique et les ions Cu 2+, c'est donc vraiment un test pour les liaisons peptidiques.

Avis des clients

Elsa Lundanes a obtenu ses diplômes universitaires à l'Université d'Oslo. Elle est professeur de chimie analytique depuis 1999. Le professeur Lundanes a (co)-écrit plus de 150 articles scientifiques et a supervisé plus de 100 étudiants en master et environ 20 doctorants. Elle est élue membre de l'Académie norvégienne des sciences et des lettres.

Lésur Reubsaet a obtenu ses diplômes universitaires à l'Université libre d'Amsterdam et à l'Université d'Utrecht. Il est professeur d'analyse de drogue depuis 2005 à la faculté de pharmacie de l'université d'Oslo. Il a (co)-écrit env. 70 articles scientifiques et encadré 40 étudiants en master et 8 doctorants. Depuis 2012, le professeur Reubsaet est membre du comité consultatif éditorial de Chromatographia.

Tyge Greibrokk est professeur de chimie analytique depuis 1975 et également chef du département de chimie de l'université d'Oslo. Il a pris sa retraite en tant que professeur émérite en 2012. Le professeur Greibrokk a (co)-écrit plus de 250 articles scientifiques et a supervisé plus de 120 étudiants en master et 30 doctorants. Il est membre élu de l'Académie norvégienne des sciences et des lettres, membre honoraire de la Société norvégienne de chimie, récipiendaire de plusieurs prix et distinctions et a été rédacteur en chef du Journal of Separation Science pendant de nombreuses années.


Une procédure de fractionnement de paillasse

La section suivante comprend une description détaillée du protocole de fractionnement de paillasse. Pour appuyer l'application, la procédure de fractionnement est illustrée à la figure 2. Dans une première étape, environ 10 à 20 mg de matériau de feuille finement broyé et lyophilisé ont été mis en suspension dans 10 ml d'un heptane pré-refroidi (4&# x000B0C) (C7H16 𠇇H”)-tétrachloroéthylène (C2Cl4 “TCE”)-mélange avec une densité de ρ = 1,3 g cm 𢄣 (rapport 7H:TCE = 0,484:1). Dans un deuxième temps, le matériel végétal en suspension a été broyé sur de la glace dans un broyeur de tissus en verre de 15 ml avec un mortier étanche (Dounce Tissue Grinder, Wheaton USA) afin de réduire davantage la taille moyenne des particules du matériel végétal (Figure 2 étapes 1𠄴). Après homogénéisation, les flacons en verre ont été placés dans un bain à ultrasons rempli d'eau glacée (Bandelin Sonorex, Typ RK 100, 50/60 Hz) et soniqués pendant 10 min. Toutes les 2 min, les échantillons ont été vérifiés pour s'assurer qu'ils restaient glacés. Après sonication, la taille moyenne des particules était de l'ordre de nanomètres à de faibles micromètres (image supplémentaire 1). La suspension soniquée a été filtrée à travers une gaze de nylon à pores de 22 � μm (Miracloth, Calbiochem) dans un tube de réaction de 50 ml. Le broyeur de verre a été rincé avec 10 ml d'heptane pré-refroidi qui a ensuite été filtré à travers la gaze et rassemblé avec l'échantillon filtré. La suspension filtrée regroupée a été centrifugée avec 4400 g à 4&# x000B0C pendant 10 min (Figure 2 étapes 5𠄷). Le surnageant a été jeté aussi efficacement que possible et le culot restant, contenant toujours environ 50 &# x003BCL du surnageant, a été remis en suspension dans 1 ml de tétrachloroéthylène et transféré dans un tube de réaction de 2 ml (figure 2 étape 8). L'estimation du surnageant restant dans le culot a été réalisée à l'aide d'une pipette et est nécessaire pour approximer de manière fiable la première densité de gradient (fraction 𠇏,” indiquée comme ρ > 1,55). Les échantillons ont été soniqués pendant 10 min dans un bain à ultrasons d'eau glacée, puis centrifugés dans une microcentrifugeuse de paillasse avec 21 100 g à 4 & X000B0C pendant 10 min (Figure 2 étapes 9� images dans les images supplémentaires 1, 2). Après centrifugation, il y avait une scission en surnageant (“s”) et en pastille (“p”). Au pas 12s (Figure 2), le surnageant a été transféré dans un nouveau tube de réaction de 2 ml et dilué avec de l'heptane selon l'étape de gradient suivante. La quantité d'heptane ajouté dépend de la densité souhaitée suivante et est calculée comme décrit dans l'équation (1). La formule contient la somme des concentrations massiques de je composants d'une solution divisés par le volume total :

Ici, mje représente la masse, Vje le volume et Vle total le volume total de solution.

Figure 2. Aperçu schématique de la procédure de fractionnement de paillasse. Récolte, broyage des feuilles et sonication (Étapes 1𠄵) Filtration, collecte des matières et séparation des fractions (Etapes 6𠄹) Centrifugation (Étape 10) Flux de travail itératif du surnageant (“s”) avec une nouvelle densité, sonication et centrifugation (étapes 12�s) Rupture de la boucle de surnageant (Etape 13l) Remise en suspension des granulés (“p”), génération d'aliquotes et lavage (Étapes 12�p) Séchage de l'échantillon (Étape 15). 7H, n-Heptane TCE, Tétrachloroéthylène.

Par exemple, étant donné un volume de surnageant de 1,050 ml avec une densité de 1,55 g cm 𢄣 et une densité souhaitée de 1,45 g cm 𢄣 dans la prochaine étape de centrifugation, l'insertion de tous les volumes et densités dans l'équation (1) révèle le volume X d'heptane (ρ = 0,68 g cm 𢄣 ) auquel il faut ajouter :

Résoudre pour X révèle X = 0,137 mL, c'est-à-dire qu'il faut ajouter 0,137 mL d'heptane au surnageant.

Le tube de réaction avec la nouvelle densité a été à nouveau soniqué dans un bain de glace pendant 10 min et ensuite centrifugé avec 21 100 g à 4&# x000B0C pendant 10 min (Figure 2, étapes 13�s images dans l'image supplémentaire 2). Ensuite, la procédure itérative a recommencé pour la deuxième fraction et s'est poursuivie jusqu'à ce que la densité finale soit atteinte (figure 2, étape 15s). Des exemples de différents gradients de densité sont fournis dans les suppléments (Données supplémentaires 1). Les pastilles restantes après l'étape 12 ont été dissoutes dans 900 μL heptane-tétrachloroéthylène selon la densité de la fraction correspondante et ont été aliquotées en trois sous-fractions. Ces trois sous-fractions ont été lavées avec 1 ml d'heptane et centrifugées pendant 3 min avec 21 100 g à 4°C. Par la suite, 800 μL du surnageant ont été jetés (figure 2, étapes 12�p). Le surnageant de la dernière fraction “l” (fraction numéro 1) a été aliquoté en sous-fractions, par exemple 3, et 500 μL d'heptane ont été ajoutés, centrifugés à 21 100 g 4ଌ pendant 3 min et le surnageant a été conservé (Figure 2, étape 13l). Les échantillons ont été séchés dans un concentrateur sous vide (LaboGene™, Danemark) et stockés à �ଌ jusqu'à leur utilisation pour la mesure de l'activité enzymatique et l'analyse du métabolome (Figure 2, étape 15).

Après la procédure de fractionnement, les activités enzymatiques marqueurs ont été déterminées par photométrie, c'est-à-dire l'activité de l'activité de la pyrophosphatase plastidiale, l'uridine cytosolique 5′-diphosphoglucose pyrophosphorylase et la phosphatase acide vacuolaire. Enfin, la distribution relative des activités enzymatiques marqueurs pour le plaste, le cytosol et la vacuole a été déterminée, ce qui a permis la corrélation avec les niveaux de métabolites.

À ce stade, nous aimerions faire quelques remarques techniques générales qui, selon nous, sont d'une importance capitale pour un flux de travail réussi : tous les solvants utilisés ont été pré-refroidis, le travail a toujours été effectué sur de la glace et sous la hotte et une attention particulière doit être donné que les échantillons ne sont pas contaminés par de l'eau. Tous les moulins à verre ouverts étaient recouverts de papier d'aluminium lorsqu'ils n'étaient pas utilisés. La conception et l'application des gradients de densité peuvent différer considérablement entre les espèces, les organes, les tissus et les types de cellules. Bien qu'il soit difficile de prédire quel gradient doit être appliqué à un type de tissu ou de cellule non caractérisé, nous recommandons de commencer par un gradient linéaire couvrant une large plage de densité, par exemple, un gradient allant de 1,2 à 1,55 g cm 𢄣 (pour des informations détaillées exemples de gradients, veuillez vous référer aux données supplémentaires 1). Résultats de la premier Les mesures des marqueurs enzymatiques indiqueront alors si le gradient linéaire choisi convient à une séparation nette ou si davantage d'étapes de densité sont nécessaires pour résoudre une certaine plage de densité.


Définition de la chromatographie de filtration sur gel

La chromatographie par filtration sur gel peut être définie comme la méthode de chromatographie qui utilise des matériaux poreux perles de gel de spécifique porosité pour isoler les composants en fonction de leurs tailles moléculaires. Cette technique retient ou exclut principalement les particules à base de différence de taille, c'est pourquoi elle est également connue sous le nom de chromatographie d'exclusion stérique ou d'exclusion de gel. Il aide principalement à l'isolement des biomolécules comme les protéines, les peptides et les oligonucléotides.

Phases de la chromatographie par filtration sur gel

Phase mobile: Les solvant qui traverse la colonne est la phase mobile. L'échantillon à tester doit être dilué dans un solvant organique approprié, puis filtré et enfin passé sur la colonne. La séparation d'un mélange à plusieurs composants a lieu dans la colonne.

État stationnaire: Les colonne inclus avec gel microporeux billes agit comme la phase stationnaire. Séphadex hydroxypropylé, polyacrylamide réticulé, gel d'agarose et sont principalement utilisés pour séparer différentes biomolécules.

Principe

Le principe de la chromatographie d'exclusion stérique repose principalement sur l'isolement de biomolécules basé sur des différences de masse moléculaire ou Taille. La technique de filtration sur gel utilise des billes de gel sphériques avec une porosité définie comme Matériau d'emballage dans la colonne de chromatographie.

Dans la chromatographie par filtration sur gel, les composants d'un mélange liquide traversent une colonne de billes de gel poreux, où certaines éluer plus tôt ou plus tard à travers la colonne, en fonction de la limite d'élution. Les limite d'élution est un facteur qui décide de la rétention ou de l'exclusion des molécules éluées à travers la colonne.

Les molécules possédant un poids moléculaire élevé par rapport à la limite d'élution seront éluées tôt, tandis que les molécules qui possèdent un poids moléculaire ou une taille inférieurs à la limite d'élution seront éluées plus tard. Par conséquent, de cette manière, les particules sont séparées dans la chromatographie de filtration sur gel.

Procédure

Le processus de chromatographie par filtration sur gel comprend les étapes séquentielles suivantes :

  1. Tout d'abord, une colonne de billes de gel sphériques est préparée pour la chromatographie de filtration sur gel.
  2. Le lit garni est équilibré avec un tampon.
  3. Ensuite, la solution d'essai (phase mobile) est éluée à travers la colonne.
  4. Après cela, les particules de l'échantillon d'essai entreront ou diffuseront hors de la matrice de gel poreux (phase stationnaire).
  5. Les molécules qui ont une petite taille moléculaire entreront dans les pores du gel, c'est-à-dire que les petites molécules couvriront un chemin plus long ou resteront plus longtemps sur la colonne.
  6. Les molécules possèdent une grande taille moléculaire ne peuvent pas entrer dans les pores de la bille de gel ou passer facilement à travers la colonne.
  7. Ainsi, la séparation des particules se produit à différents intervalles, en suivant l'isolement et l'identification des composants séparés.

Le fractionnement et le dessalage sont les méthodes qui réalisent la séparation des composants dans la chromatographie d'exclusion stérique.

Dessalage: Les molécules lourdes sont éluées, en maintenant la limite d'exclusion du gel plus petite, de sorte que les plus petites molécules peuvent piéger dans les pores du gel, tandis que les plus grosses particules se séparent.

Fractionnement: Dans cette méthode, les molécules cibles sont isolées qui résident à l'intérieur de la matrice de gel, dont la taille moléculaire doit être dans la plage de fractionnement du gel.

Résultats

Les molécules séparées de l'unité de chromatographie par filtration sur gel dépendent de la distribution granulométrique du gel microporeux. Il aide à construire un courbe d'étalonnage qui à son tour détermine le poids moléculaire d'un analyte inconnu dans l'échantillon en comparant le poids moléculaire d'analytes connus.

Applications

  1. La chromatographie par perméation de gel est une méthode robuste pour la purification de biomolécules comme les enzymes, les polysaccharides, les acides nucléiques, les protéines, etc.
  2. L'unité de filtration sur gel peut permettre renaturation de protéines dénaturées.
  3. Il est utilisé dans fractionnement des protéines expériences.
  4. En employant la chromatographie par filtration sur gel, le poids moléculaire des particules séparées peut être examiné.
  5. C'est une méthode qui permet d'examiner la structure quaternaire des protéines purifiées.

Avantages

  • La filtration sur gel peut séparer les biomolécules, sensibles aux variations de pH, de température, de concentration d'ions métalliques, etc.
  • Les particules ne collent pas au support de chromatographie, comme dans une chromatographie échangeuse d'ions.
  • L'explication du résultat peut être faite dans un temps minimal.
  • Cela donne une séparation bien définie.
  • Une petite quantité d'échantillon d'essai suffit pour conclure les résultats.
  • Le débit peut être réglé.

Limites

  • L'échantillon d'essai doit être filtré avant de le passer dans la colonne de filtration sur gel pour éviter le colmatage de particules à l'intérieur de l'instrument.
  • L'instrument doit être sans poussière et d'autres particules pouvant interférer avec l'interprétation des résultats.

Conclusion

Par conséquent, la chromatographie par filtration sur gel est une technique qui dépend de la masse moléculaire de la biomolécule, répartition des tailles de billes de gel et limite d'élution. Le mouvement des petites molécules est plus lent que celui des grosses molécules, en raison de la diffusion rapide dans les pores. À l'opposé, les plus grosses particules incapables de se déplacer dans les pores, se déplacent donc plus rapidement et sont éluées.


Qu'est-ce que la chromatographie ?

Si vous travaillez dans l'industrie chimique, vous devez avoir entendu parler de la technique de la chromatographie. Bien qu'il s'agisse d'une procédure courante, de nombreuses personnes ne savent toujours pas ce qu'est la chromatographie et comment elle fonctionne exactement. Si vous êtes également confus sur le sujet, vous êtes au bon endroit. Cet article comprend tous les détails sur la chromatographie. Commençons par le sens et la définition de la chromatographie.

Signification de chromatographie

Selon la définition du dictionnaire, la chromatographie est une méthode pour séparer les constituants d'une solution (gaz ou liquide) en exploitant les différentes propriétés de différentes molécules. La technique utilise une phase mobile (gaz ou liquide) pour transporter la solution à analyser à travers la phase stationnaire (solide ou liquide) qui absorbe ou empêche différents composants de la solution à des degrés différents et provoque ainsi leur séparation en différentes couches. C'est un outil précieux entre les mains des scientifiques analytiques pour la séparation et la quantification des composants dans un mélange de composés organiques.

Histoire et bases de la chromatographie

La technique trouve son origine dans les travaux pionniers de Mikhail Tswett qui séparait les pigments végétaux en 1900 à l'aide d'une colonne de verre garnie. Comme les pigments séparés étaient de couleur différente et séparés en bandes distinctes, la technique a été inventée comme la chromatographie, ce qui signifie la séparation par couleurs.

Au fil des ans, la chromatographie a évolué et a évolué vers des versions telles que HPLC, GC, HPTLC et SFC qui, à ce jour, sont toutes basées sur la séparation des composants du mélange par le biais d'interactions physico-chimiques sélectives et d'un partage entre les phases stationnaire et mobile.

Pourquoi utilisons-nous la chromatographie ?

Depuis son évolution, la chromatographie a trouvé une large utilisation dans la séparation des composants de mélanges allant des gaz les plus simples aux mélanges d'hydrocarbures les plus complexes contenant des centaines de composés différents. Les échantillons peuvent être gazeux, liquides ou même solides qui sont facilement solubles dans des solvants appropriés.

En raison de sa polyvalence, les applications couvrent une gamme complète de composés chimiques ayant diverses caractéristiques telles que la plage d'ébullition, les poids moléculaires, les volatilités et les stabilités thermiques. La chromatographie en phase gazeuse, la chromatographie en phase liquide, la chromatographie en couche mince, la chromatographie en phase fluide supercritique et les techniques de trait d'union telles que GC - MS et LC - MS couvrent un grand nombre d'applications dans divers domaines tels que les produits pharmaceutiques, le développement de matériaux, les aliments, les produits pétroliers et la médecine légale. investigations nécessitant une résolution et des limites de détection très élevées.

Quelques applications de la chromatographie dans différentes industries sont :

Industrie chimique
  • Détection de contaminants dans les pesticides et les huiles
  • Analyse d'échantillons d'eau
  • Contrôles de la qualité de l'air
  • De nombreuses applications en sciences de la vie
Industrie pharmaceutique
  • Prendre la composition des éléments et leur poids moléculaire pour séparer les composés
  • Pendant le processus de développement d'un médicament
  • Détection de produits chimiques ou d'oligo-éléments dans divers échantillons avec une analyse appropriée
  • Examen de la pureté du mélange
  • Identification de composés inconnus
Industrie médico-légale
Industrie alimentaire
  • Identifier les valeurs nutritionnelles et la qualité des produits alimentaires
  • Détection des additifs et de la détérioration des aliments
Études de biologie moléculaire
  • L'industrie des carburants, les procédés biochimiques et la biotechnologie utilisent la HPLC pour le processus de purification et de fractionnement
  • Etude métabolomique et protéomique par des techniques de chromatographie spécifiques
  • Recherche d'acide nucléique avec des méthodes de chromatographie spécifiques

Ce ne sont que les applications populaires de la chromatographie. La technique est utilisée dans divers autres endroits et industries.

Fonctionnement de base de la chromatographie

Le processus exact de chromatographie dépendra de l'endroit où vous souhaitez l'utiliser et de la méthode que vous choisissez (ceux-ci seront explorés plus loin dans l'article). Cependant, nous pouvons toujours définir une procédure de base qui consiste en quatre étapes simples :

  • Étape 1 : exposition prudente d'une quantité d'analyte spécifique au flux de phase mobile qui était déjà en cours d'exécution.
  • Étape 2 : Ensuite, l'analyte passe par la phase stationnaire à l'aide de la phase mobile.
  • Étape 3 : Enfin, la séparation a lieu lorsque les composants de l'analyte réagissent avec la phase stationnaire à différents niveaux. Certains réagissent davantage, d'autres non.
  • Étape 4 : Les composants d'analyte séparés sont ensuite à nouveau effectués par la phase mobile. Il transporte ensuite les composants vers un instrument séparé. There, they get quantified with the proper detection of their presence.

And in these four steps, the process gets complete. We can say that chromatography is divided into three basic components: Mobile Phase, Stationary Phase, and Separated Molecules.

Let’s now get into the details of the use of different parts of chromatography.

Chromatography Parts

The four steps aren’t enough to understand how chromatography works. You also need to know about the different elements of the process, along with their working. Only then will you be able to learn the concept.

Chromatography Columns

Separation of sample components before detection is the essence of chromatographic techniques. A chromatographic system uses a column to achieve the desired separation. A column comprises of a tube packed with a stationary phase on which separation takes place based on physico – chemical interactions of separating compounds with the stationary phase. The mobile phase or the carrier gas elutes less weakly retained components first followed by more strongly retained components.The column dimensions and composition is based on the chromatographic technique selected and the degree of required separation. In general HPLC columns are shorter and wider than GC columns.

Chromatographic Detectors

After separation the individual components reach the detector which provides response in terms of the area or peak height depending on the amount of the eluting compound. Each chromatographic separation technique offers a range of detectors depending on the nature of eluting compounds.

Detection can be specific for a particular compound or a range of compounds or it can depend on some physical properties such as reflective index of the mobile phase. Such detectors are referred to as bulk property detectors in comparison to selective or specific detectors.

Chromatographic Data

Chromatographic separations appear as peaks in the chromatogram except for thin-layer chromatography for which separate zones are seen on the plate. Chromatographic peaks are separated in time in the chromatogram depending on the nature of separating compounds and the separation efficiency of the column. Sharp well resolved peaks indicate high degree of column resolution whereas broad or overlapping peaks are indicative of poor resolution.

Each peak represents a sample component and is characterized by its retention time under defined operating conditions. For purposes of quantification the peak height or more accurately the area under the peak defines the amount of the component present in the mixture.

Quantitation methods require percentage composition of a particular component in the mixture and such estimations are made on the presumption that the detector responds to all the components equally and peaks are generated for each compound.

Quite often the amount of analyte is specified in relation to another compound which is referred to as a reference standard having established traceability. Such compounds should be available in pure form and have chemical identity which is same or close to the identity of the analyte to be determined.

Modern-day analytical systems come equipped with sophisticated application softwares which are capable of operational control, data interpolation and calculations to achieve the desired results.

Common Chromatography Methods

A few general chromatography methods that are divided based on the separation basis of the elements are:

Now you have the answer to the basic question ‘What is chromatography?’you will be eager to know more about the chromatographic techniques .Simply register to our free courses and advanced certificate programmes listed under courses on the main menu.


Paper Chromatography Report

introduction
The purpose of this experiment is to observe how chromatography can be used to separate mixtures of chemical substances. Chromatography serves mainly as a tool for the examination and separation of mixtures of chemical substances. Chromatography is using a flow of solvent or gas to cause the components of a mixture to migrate differently from a narrow starting point in a specific medium, in the case of this experiment, filter paper. It is used for the purification and isolation of various substances. A chromatographically pure substance is the result of the separation. Because purification of substances is required to determine their properties, chromatography is an indispensable tool in the sciences concerned with chemical substances and their reactions.

Chromatography is also used to compare and describe chemical substances. The chromatographic sequence of sorbed substances is related to their atomic and molecular structures. A change in a chemical substance produced by a chemical or biological reaction often alters the solubility and migration rate. With this knowledge, alterations or changes can be detected in the substance.

In all chromatographic separations, there is an important relationship between the solvent, the chromatography paper, and the mixture. For a particular mixture, the solvent and the paper must be chosen so the solubility is reversible and be selective for the components of the mixture. The main requirement, though, of the solvent is to dissolve the mixture needing to be separated. The porous paper used must also absorb the components of the mixtures selectively and reversibly. For the separation of a mixture, the substances making up the mixture must be evenly dispersed in a solution, a vapor, or a gas. Once all of the above criteria have been met, chromatography can be a simple tool for separating and comparing chemical mixtures.

Hypothesis
Paper can be used to separate mixed chemicals.

Matériaux
The materials used for this lab are paper, pencil, eraser, filter paper, test tube, rubber stopper, paper clip, metric ruler, black felt-tip pen, and a computer.

Méthodes
The first step of the method is to bend a paper clip so that it is straight with a hook at one end. Push the straight end of the paper clip into the bottom of the rubber stopper. Next, you hang a thin strip of filter paper on the hooked end of the paper clip. Insert the paper strip into the test tube. The paper should not touch the sides of the test tube and should almost touch the bottom of the test tube. Now you will remove the paper strip from the test tube. Draw a solid 5-mm-wide band about 25 mm from the bottom of the paper, using the black felt-tip pen. Use a pencil to draw a line across the paper strip 10 cm above the black band.

Pour about 2 mL of water into the test tube. The water will act as a solvent. Put the filter paper back into the test tube with the bottom of the paper in the water and the black band above the water. Observe what happens as the liquid travels up the paper. Record the changes you see. When the solvent has reached the pencil line, remove the paper from the test tube. Measure how far the solvent traveled before the strip dries. Finally, let the strip dry on the desk. With the metric ruler, measure the distance from the starting point to the top edge of each color. Record this data in a data table. Calculate a ratio for each color by dividing the distance the color traveled by the distance the solvent traveled.

Résultats
The results of the experiment are shown in a chart and a graph.

Color of Ink (listed in order) Distance each Color Traveled (mm) Distance Solvent Traveled (mm) Ratio Traveled
(Distance color moved divided by distance solvent moved)
Jaune 70 mm 111 mm .63
Pink 82 mm 111 mm .74
rouge 101 mm 111 mm .91
Violet 110 mm 111 mm .99
Blue 111 mm 111 mm 1.0

1. How many colors separated from the black ink? Five colors separated from the black ink: yellow, pink, red, purple, and blue.

2. What served as the solvent for the ink? Water served as the solvent for the ink. As the solvent traveled up the paper, which color of ink appeared first? The color orange first appeared as the solvent traveled up the paper.

3. List the colors in order, from top to bottom, which separated from the black ink. The colors separated in this order, from top to bottom: blue, purple, red, pink, and then yellow.

4. In millimeters, how far did the solvent travel? The solvent traveled 111 mm.

5. From your results, what can you conclude is true about black ink? Black ink is a mixture of several different colors.

6. Why did the inks separate? The inks separated because the black ink was a mixture of different pigments with different molecular characteristics. These differences allow for different rates of absorption by the filter paper.

7. Why did some inks move a greater distance? The ink least readily absorbed by the paper would then travel the farthest from the starting mark. You can conclude from this information that the different pigments were absorbed at different rates.

Error Analysis
Possible errors could include inaccurate measurements of the distances traveled by the inks and mistakes when calculating the ratio traveled by the water and colors. If a longer test tube was used, a longer strip of filter paper could have been used. This may have changed the ratios. Another color may have been present, but not detected because of the filter paper length.

Conclusion
The proposed hypothesis was correct. The paper chromatography did show that black ink could be separated into various colors. The black ink gets its color from a mixture of various colored inks blended together. The first color of ink to appear on the filter paper was yellow followed by pink, red, purple then blue. The colors separated the way they did because of the differences in their molecular characteristics, specifically, their solubility in water and their rate of absorption by the paper. The most soluble and readily absorbed ink color was the yellow. The least soluble and least absorbable ink color was the blue.


About the Journal

The Journal of Chromatography and Separation Techniques is a peer-reviewed (refereed), academic, open-access, international scientific journal which provides a global scholarly platform to scientists, academicians and researchers to disseminate knowledge to the tertiary end users in the form of critical and informed articles related to separation science.

The Journal of Chromatography and Separation Techniques publishes research papers and critical reviews on all aspects of separation science including developments in separation science relevant to biology and biomedical research. The scope includes Chromatography and related techniques, Electrophoresis, Extraction, Evaporation, Centrifugation, Crystallization, Distillation, Decantation, Sublimation, Magnetic Separation, Precipitation, Filtration, Adsorption, Thermo-gravimetric analysis, Mass Spectrometry, Micro-analytical techniques, Electro-migration techniques, sample preparation, Spectroscopic Methods, Chiral Separations, Nano-fluidic and Micro-fluidic Separations, Ion Suppression and Matrix-effects in separation, The qualitative and quantitative analysis of biopolymers including monoclonal antibodies, proteins, peptides (post-translational modifications), nucleic acids and glycans The comparative analysis of biological systems using lipidomics, metabolomics, genomics, proteomics and other "omics" approaches Clinical analysis, toxicological analysis, doping analysis, therapeutic drug monitoring, metabolism, veterinary applications, analysis of environmental contaminants in biological systems The screening and profiling of cells, tissues, body fluids, biological matrices and systems analysis of endogenous compounds and biomarkers Identification of new bioactive compounds hyphenated techniques and other multi-dimensional techniques.

The Journal of Chromatography and Separation Techniques accepts manuscripts on all aspects of separation science theory and methodology, instrumental developments and analytical and preparative applications. Developments related to preparative separations for the isolation and purification of components of biological systems are accepted, including chromatographic and electrophoretic methods, affinity separations and other preparative approaches.

Novel research and developments like improved analytical performance, combination of analytical techniques or a new approach to the separation are given importance. Reports of analytical methods for compounds in early pharmaceutical development are considered if the authors can demonstrate the broader significance of the methodology involved. Quality control analyses of bulk drugs, natural products and pharmaceutical formulations are also considered.

All submitted manuscripts are subjected to a stringent, rigorous peer-review process and are carefully evaluated based on originality and clarity of exposition.


8.2: Fractionation and Chromatography Techniques - Biology

An overview of subcellular fractionation methods.

Separation of cellular compartments from one another is an important step for studying a specific intracellular structure or organelle or protein, or to assess possible associations between these macromolecular structures. Subcellular fractionation uses one or more of the properties of each compartment, such as buoyant density, surface charge density, size and shape, and is mainly based on differential centrifugation in media of high viscosity at 4°C. Media used for differential centrifugation are mainly sucrose, mannitol, glycerol, Ficoll 400 (a polymer of sucrose), Percoll (a type of colloidal silica) and iodixanol (OptiPrep, e.g., Hela or THP1 cell fractionation for cGAS activity assay [4] ). Sucrose is widely used because it is inexpensive. But they all have their advantages and limitations, which are discussed in detail by Harford and Bonifacino, 2011. Mainly these methods will be discussed here, with a preference for the ones that are easily accessible to most labs and are less time-consuming, as speedy recovery is vital. Gel filtration, affinity chromatography, electrophoresis or selective density-shift perturbation can also be used. Variations in the conditions of the available protocols are dependent on the organelle, tissue or cell type and equipment used, and it is highly recommended to read the cited references for full details of each procedure. In the end, the purity and the yield of the fractionation should be assessed by detection of distinct markers in each collected fraction during the entire procedure. The isolation methods for biological condensates and exosomes are discussed elsewhere.

Sequential centrifugation can be used to prepared endosomes. For example, neuronal endosomes were obtained through first lyzing neurons with 20 times of syringe aspiration in lysis buffer (250 mM sucrose, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 5 mM MgCl2, 1mM EDTA, 1mM EGTA) along with protease inhibitor mixture and then going through sequential centrifugation at 1000 x g for 10 min, 16,000 x g for 20 min, and 100,000 x g for 60 min at 4°C [5].

Synaptosomes, or isolated nerve terminals, are commonly used to study the structure, molecular mechanisms and functions of synapses. The general procedure for synaptosomal preparations involves the homogenization of brain tissue followed by differential centrifugation of the homogenate at low speed (600g or 1000g) to pellet tissue debris and then centrifugation of the resulting supernatant at high speed (20,000g or 14000g) to separate mitochondria and synaptosomes [1, 6]. Figure 1 shows a schematic diagram of the general methods for synapse and synaptosome preparations. Synaptosomes can be further homogenized and centrifuged to separate synaptosomal membranes from synaptosomal cytosol [7].

Synaptosome preparations obtained by slight variations of the method described above have already been used for several types of studies in the neuroscience field, especially studies that determine the functions of specific synaptic proteins [8-10], proteomic and phosphoproteomic analysis [11, 12], and studies of disease-specific genes [8, 13] and local protein synthesis in neuronal pre- and postsynaptic compartments [14]. Moreover, synaptosomes have been labeled with various compounds and used as platforms for loading synaptic vesicles with desired markers [15].

Commercial reagents that facilitate synaptosome isolation are also available, but so far, less popular, most probably due to higher cost. Syn-Per Synaptic Protein Isolation Reagent from Thermo Scientific has been used by several groups [16-19]. Sigma Aldrich’s Synaptic Vesicles Isolation Kit SV0100 was also used [20, 21], but seems to have been discontinued (Sigma Aldrich Catalog as of Oct 11th, 2018). Already prepared synaptosomal fractions can be purchased from Synaptic Systems (SySy).

Cytoplasmic, nucleoplasmic and chromatin fractions can be easily prepared from a pellet of cultured cells [2]. Cells are resuspended in a buffer containing 0.34 M sucrose, 10% glycerol and low concentration of a mild detergent (0.1% Triton X-100) as well as K + and Mg +2 (which protect the nuclei from breaking) and the nuclei are pelleted by low-speed centrifugation while the supernatant is kept as the cytoplasmic fraction. Next, nuclei are lysed in a buffer containing chelating agents EDTA and EGTA and the insoluble chromatin fraction is pelleted by low-speed centrifugation while the supernatant is the nucleoplasmic fraction [2] (Figure 2).

Some researchers use a 'quick and dirty' preparation of chromatin with its associated proteins from the cytoplasm/nucleoplasm. This is simply performed by lysing the cells in a lysis buffer containing 1% Triton X-100. In this buffer, chromatin and some cytoskeletal structures are insoluble and they can be recovered by centrifugation. The pellet can be resuspended in the buffer of choice e.g., Laemmli for SDS PAGE [22].

A cytosol-enriched fraction can be prepared with 250 mM sucrose and without any detergents through centrifugation at 2000g to remove nuclei and cellular debris and ultracentrifugation at 75,000g to get rid of other cellular components [23].

  1. Cell pellets, grown as a monolayer or in suspension, are homogenized in a homogenization buffer containing MgCl2 and KCl. Later, sucrose is added up to 0.25 M and the nuclei are pelleted by low-speed centrifugation (1000 g). Second centrifugation of the supernatant at 5000 g will sediment the mitochondria. The pellet is resuspended in a medium containing sucrose and Mg +2 and is subjected to a few gentle strokes in a Dounce homogenizer. The last centrifugation step at 5000 g will enrich mitochondria which can be resuspended in Tris buffer containing 0.25 M sucrose or in the buffer of preference for subsequent analyses (e.g., Laemmli) [24].
  2. Yeast cells are treated with zymolase to break the hard outer wall and produce spheroplasts, which are washed in a sorbitol buffer. The pellet is resuspended in homogenization buffer containing 0.6 M mannitol and cells are lysed by a few strokes in a Dounce homogenizer. Nuclei are removed by low-speed centrifugation, while the cytoplasm-containing supernatant is centrifuged in a fixed-angle rotor at 6500 g to pellet mitochondria.

Additionally, there are protocols that utilize density-gradient separations which provide purer mitochondrial fractions, but they are more time-consuming and are avoided. Despite the "contamination" by lysosomes and peroxisomes in fractions obtained by the differential centrifugations, they are the method of choice. Therefore, the desired purity determines which the most suitable method is. For example, if metabolic studies are of interest, differential centrifugation is preferred alternatively, if the exact localization of a protein is under investigation or samples of the purest form are a necessity, e.g., in proteomics, the density-gradient preparations are more suitable.

Mitochondria can also be immuno-isolated, the MitoIP protocol. Laflamme C et al isolated mitochondria from the HEK293 cells transfected with 3xHA-eGFP-OMP25 (Addgene #83356) with anti-HA magnetic beads from Thermo Fisher Scientific (cat# 88837) [25].

Mitochondria have a complex structure comprising the matrix, inner mitochondrial membrane (IMM), intermembrane space and the outer mitochondrial membrane (OMM) which as attached to the inner membrane at "contact sites". Protocols have been published which enable the enrichment and isolation of the various mitochondrial compartments. Isolation of OMM from yeast [26] and rat liver [27] both involve isolation of mitochondria followed by osmotic swelling/shrinking to release the OMM followed by density gradient centrifugation to yield highly purified OMM. Whilst purity is high, OMM yields are typically 1% of total mitochondrial protein. The detachment of the OMM releases the proteins of the intermembrane space. The ‘mitoplasts’ devoid of OMM are a source of enriched IMM. Lysis of the mitoplasts releases the proteins of the mitochondrial matrix.

Methods have also been published for the isolation of mitochondrial-associated membranes (MAM) which connect mitochondria and the endoplasmic reticulum and play an important role in phospholipid metabolism [28-30].

Smith et al [31] used a postnuclear supernatant obtained by a 2,000 g centrifugation, which was then re-centrifuged at 20,000 g for 30 min. The pellet, which contained peroxisomes and mitochondria, was resuspended in MS buffer (0.65 M sorbitol, 5 mM MES, pH 5.5) and was placed on top of a gradient of Nycodenz (17%, 25%, 35%, 50%) in MS buffer. After centrifugation at 116,000 g for 2h, peroxisomes are present in fractions 2 to 8.

Further separation of the peroxisomal membrane-associated proteins was achieved by the Fujiki (1982) and Nuttley et al 1990 method, as cited in [31]. The pellet from the aforementioned 20,000 g centrifugation was resuspended in 10 volumes of Ti8 buffer (Tris 10mM, pH 8.0 and PINS (1 mM EDTA, 0.2 mM PMSF, 2 μg leupeptin/ml, 2 μg aprotinin/ml, and 0.4 μg pepstatin A/ml)) and separated at 200,000 g for 1 h. The pellet, with the peroxisomal membranes, was resuspended again in Ti8 buffer and by addition of 0.1 M sodium carbonate and subsequent centrifugation at 200,000 g for 1 h, the peroxisomal membranes were separated from the proteins which were associated with but not integral to the membranes.

Lysosomes, mitochondria and peroxisomes have very similar densities in sucrose gradients therefore it is preferred to avoid this method. In Percoll, they are denser and such method results in lysosomes with little or no contamination by other organelles.

Washed cells are homogenized with 5 passes in a homogenizer in a 3 mL buffer containing 0.25 M sucrose. An 800 g centrifugation for 10 min will pellet the intact nuclei and debris and the supernatant is stored on ice. The nuclear pellet is resuspended in 0.5 mL of the same buffer, re-centrifuged as before and the supernatant is pooled with the supernatant of the first centrifugation. In this solution, Percoll stock solution (containing 0.25% sucrose) and bovine serum albumin (BSA) are added to a final concentration of 20% (Note: this can be increased to 27%-35%) and 0.4%, respectively (final volume 4.5 mL), and centrifuged at 36,000 g for 30 min (Note: this can vary from 15,000 g for 60 min to 62,500 g for 40 min). The gradient is collected with a gradient unloader in 0.4 mL fractions and the lysosomes are usually close to the bottom of the gradient. To better solubilize the lysosomes and increase recovery, NP-40 is added to a final concentration of 0.5%, before being centrifuged at 100,000 g for 1-2 h. But if intact organelles are of interest e.g., for metabolic assays, NP-40 should be avoided [32].

Lysosomes can be immuno-isolated with the LysoIP protocol. Commercial kits for lysosome enrichment are available. Yoon I et al obtained HEK293T cell lysosomes with Lysosome enrichment kit from Thermo Fisher Scientific using discontinuous Optiprep density gradient centrifugation for Western blotting [33] so did MC Silva et al with differentiated neurons [34]. Laflamme C et al isolated lysosomes from HEK-293 cells transfected with Tmem192-3xHA (Addgene #102930) with anti-HA magnetic beads from Thermo Fisher Scientific (cat# 88837) [25].

Kushimoto et al and Basrur et al used a discontinuous gradient of sucrose in HEPES buffer [35, 36]. More specifically, the cell lysate was resuspended in 2 M sucrose and layered on top of a discontinuous sucrose gradient (1.0, 1.2, 1.4, 1.5, 1.6, 1.8, 2.0 M). After centrifugation at 100,000 g for 1 h, the early stage melanosomes (stage I and II) were recovered in the zone of about 1.0-1.2 M sucrose. This enriched fraction was further separated into tyrosinase-rich and protein-rich fractions by Free-Flow Electrophoresis (FFE) on an Octopus-PZE FFE apparatus at 2.0 ml/hr. FFE was performed at 1000–1100 V and ≈110–125 mA by using 0.25 M sucrose in triethanolamine, pH 7.4, with an elution flow rate of 3–4 ml/min [36]. This procedure gave highly enriched melanosomal samples for proteomics analyses which identified >60 melanosomal proteins [35].

Another protocol which results in melanosomal fractions with high purity was developed by the same researchers. The cell lysate in 2 M sucrose was layered at the bottom of the discontinuous sucrose gradient. After centrifugation at 100,000 g for 1 h, the early stage melanosomes, which were recovered in the zone of about 1 M sucrose was then layered in the middle of an extended gradient of 0.8, 1.0, and 1.2 M sucrose and centrifuged again as before. This additional step completely removed mitochondria "contamination".

The late melanosomes (stage III and IV) were also recovered from the 1.8 M sucrose layer, as they contained a larger amount of melanin and thus were heavier.

Histones are the most basic proteins in the intracellular environment. This is the main characteristic used to enrich histones from cells or Xenopus laevis extracts. Resuspending intact, purified nuclei (as discussed previously) in 0.2 M HCl [37], or sulfuric acid (H2DONC4), and after incubation by rotation at 4°C, most cellular proteins precipitate while histones remain soluble and are recovered by centrifugation at 16,000 g for 15 min [38]. Details may vary. Alternatively, chromatinized histones can be extracted by incubation in 2.5 M NaCl.

A method for Golgi membranes isolation was used by Chen et al [39]. A liver tissue homogenate prepared in buffer containing 0.5 M sucrose was layered on top of 0.86 M sucrose and this was topped off with 0.25 M sucrose. After centrifugation at 103,800 g for 60 min, the membranes were collected at the 0.5-1.3 M interface and adjusted to 0.5 M sucrose.

Centrosomes can be isolated by attached epithelial cultured cells, but still not in great quantities. Andersen et al used more than 2 billion cells (2x10 9 ) [40]. Nuclei are isolated by hypotonic lysis and the centrosomes are harvested after two centrifugation steps. First, by centrifugation onto 50% sucrose cushion and subsequently by centrifugation onto a 40%,50% and 70% sucrose gradient.

Moritz et al have isolated centrosomes from Drosophila embryos as follows: a homogenate (in BRB80 buffer+100mM KCl and 14% sucrose) from 3.5h embryos was centrifuged at 1,500 g for 10 min and the lipids were removed. The supernatant was used to isolate centrosomes after addition of 0.1-0.5% Triton X-100 and 50% sucrose (final concentrations), by loading onto a sucrose gradient (4 mL of 55% and 3 mL of 70%) and centrifuging at 100,000 g for 90 min. Most centrosomes accumulated on top of the 70% cushion [41].

Migrating cells form an extension on one side, which will attach to a new site and subsequently pull the rest of the cell body to the new site. This extension is called pseudopodium. Klemke and colleagues [42] have developed a method to isolate the pseudopodium from the cell body in response to a chemotactic agent. This is achieved by using Transwell migration chambers in 6- or 24-well plates. Briefly, cells are left to attach on the upper side of the filter which has small pores of 3 microns. They are small enough so that the entire cells cannot pass. But the formed pseudopodia can pass and they will attach on the lower side of the filter, when the cells sense the chemotactic agent which has been placed in the lower compartment. Then, cells are fixed and the pseudopodia or the cell bodies can be collected by lysis in the buffer of choice [43].

Song et al have performed subcellular fractionation from mouse livers but this method could be used for other tissues, too, after some modifications [3]. A schema in Figure 3 summarizes the entire procedure. Briefly, the liver homogenate was centrifuged at 1,000 g for 10 min to separate the pellet (P1) and a soluble fraction (S1).

P1 suspended in a final buffer containing 1.8 M sucrose (for complete buffer recipes, the reader is directed to the original publications) was centrifuged at 70,900 g for 90 min and gave a pellet (P2) with the nuclei of liver cells, which can be stored, and a soluble fraction between the 0.25-1.8 M interface (S2). S2 was resuspended in 0.25 M sucrose, centrifuged at 1,200 g for 10 min., and the pellet containing the crude plasma membrane was further suspended in a final buffer containing 1.45 M sucrose and centrifuged at 68,400 g for 60 min. The soluble fraction between the 0.25-1.45 M sucrose was supplemented with a buffer containing 0.25 M sucrose and re-centrifuged at 17,600 g for 10 min. The pellet was resuspended in a final buffer containing 1.35 M sucrose and centrifuged at 230,000 g for 60 min. The 0.25-1.35 M fraction was recovered, diluted with 0.25 M sucrose and re-centrifuged at 40,000 g. The subsequent pellet contained the purified plasma membrane proteins and was stored.

The soluble fraction S1, was re-centrifuged at 8,000 g for 15 min. This afforded an insoluble fraction (P5) which contained crude mitochondria and a soluble fraction (S5) containing ER (light and heavy microsomes) as well as Golgi complex.

After washing, P5 was resuspended in a 12 mL solution containing 25% Nycodenz [44] and layered on a discontinuous Nycodenz gradient (5 mL of 34% and 8 mL of 30%) and topped-off with 8 mL of 23% and 3 mL of 20%. After centrifugation at 52,000 g for 90 min, mitochondria were recovered at the 25-30% interface. This fraction was collected and diluted in a final buffer which resulted in 200 mM mannitol and 50 mM sucrose before being centrifuged at 15,000 g for 20 min. The resulting pellet containing pure mitochondria was washed and stored.

Soluble fraction S5 was centrifuged at 34,000 g for 30 min and resulted in a pellet (P6), and a soluble fraction with the light microsomes (S4). S4 was centrifuged at 124,000 g to separate the cytosol, which was stored, from the microsomes (pellet). P6 was mixed with the light microsomes from the previous centrifugation and diluted in a final buffer containing 0.25 M sucrose and 0.015 M CsCl. The solution was laid on a 1.3 M sucrose solution and centrifuged at 237,000 g for 2 h. This separated the rough ER (pellet) from the smooth ER at the 0.25-1.3 M interface. This soluble fraction was diluted 1:1 with 0.25 M sucrose and centrifuged at 124,000 g for 60 min. The smooth ER was recovered in the pellet and stored [3].

Neuronal nuclei can also be further isolated through fluorescence-activated nuclear sorting (FANS), during which the isolated nuclei are fixed with paraformaldehyde (or ethanol), labeled with an anti-NeuN antibody or another nuclear antibody with or without an appropriate secondary antibody and counterstained with propidium iodide or DAPI in a solution containing RNase A and chicken erythrocyte nuclei [45, 46], or with variations for, for example, single-nucleus RNA-seq [47], ChIP-seq, PLAC-seq or ATAC-seq [48]. Electronically gated diploid neuronal nuclei are then determined by PI/DAPI fluorescence and immunolabeling through flow cytometry [45, 46].

Stress granules (SG), considered a type of biomolecular condensates [49], are RNA-protein complexes, which are generated in response to the effects of various exogenous stressors [50], through liquid-liquid phase transition. Each mammalian SG contains an external active phase, which dynamically interacts with encircling cytoplasm, and an RNA-protein core with high stability [51]. In comparison to mammalian stress structures, yeast SGs mainly consist of large RNA-protein cores with significantly smaller external shells.

The standard SG isolation is based on consecutive centrifugation to concentrate SG cores and immunoprecipitation to purify the obtained SGs. There are several techniques to generate SGs [52]. Separate protocols have been established for the isolation of RNA-protein SG cores from mammalian and yeast SGs [51]. Following the induction of SGc, the cells are usually lysed by several passages via a 25G 5/8 needle on ice. For the enrichment of SG scores, the cellular lysates are centrifuged at 18,000 x g for 20 min at 4oC. The purification of SGs may be achieved by either antibodies to SG structures directly or antibodies to tagged SG particles. Microscopic analysis, mass spectrometry-based exploration of protein structure and evaluation of proteins using SDS-PAGE gel are usually suggested for estimation of the efficient SG isolation. Potential problems with the isolation of SG cores include low yield of SGs or detection of SG scores in intact control samples. Low yield might be corrected by increasing initial sample volume or optimization of the antibodies for immunoprecipitation. It is recommended to wash the control cells in a cell medium rather than PBS to avoid detecting SGs in unstressed cells.

A new method of SG preparation for RNA-seq has recently been developed [53, 54]. The RNA isolation for RNA-seq is performed by the TRIZOL-based method. RNA-Seq results would be confirmed by the FISH method. Briefly, the stressed cells are fixed, stained with FISH probes and subjected to imaging using either widefield fluorescence or confocal microscopy.

In recent years, several kits for subcellular fractionation of cells, obtained both from culture and from tissues, have become commercially available. These commercial kits are, in general, aimed at the rapid isolation of fractions from relatively small quantities of cell / tissues (often 100–200 mg of cells/tissue) in a short period of time (less than 2 hours) and many of the kits require only a bench top centrifuge. Kits from different manufacturers allow for different degrees of fractionation. Some allow fractionation into cytoplasmic, plasma membrane, nuclear chromatin and cytoskeletal fractions whilst others offer a more basic fractionation into cytoplasmic, mitochondrial and nuclear fractions. Kits also exist specifically for the isolation of mitochondria from cells and tissues. For example, M Oginuma et al separated nuclear and cytoplasmic fractions from human iPS cells with the NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction kit (78833) from Thermo Fisher Scientific [55]. M Pradas-Juni et al obtained cytoplasmic and nuclear fractions from freshly isolated primary hepatocytes using Nuclei Isolation Kits: Nuclei EZ Prep from MilliporeSigma [56]. Virk HS et al prepared membrane and cytosolic lysates for western blot using Mem-PER Plus Protein Extraction Kit from Thermo Fisher Scientific [57]. Liu Y et al obtained nuclear separation through the nuclear extraction kit from EpiGentek [58]. Wang L et al prepared nuclear extracts from RAW264.7 cells with the Nuclear Complex Co-IP Kit (54001) from Active Motif for incubation with HSV-1 genomic DNA [59]. Lee YR et al separated membrane fractions of 293T, MEF, or PC3 cells for cytosolic fractions with ProteoExtract Native Membrane Protein Extraction Kit from Calbiochem to investigate the membrane recruitment of PTEM [60]. Saito T et al prepared nuclear and cytoplasmic fractions from livers and cultured cells with the NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents from Thermo Fisher for Western blotting [61].

For many uses the commercial kits may be an excellent approach, especially for non-specialist laboratories. However, there are potential drawbacks. The isolation buffers often contain detergents which may interfere with protein function. Furthermore, the often proprietary nature of the buffers makes it difficult for the more experienced researcher to fine tune the isolation depending on the precise cell source and/or end use of the isolated fractions.

Some of subcellular fractions are directly available from commercial suppliers, for example, microsomes from Sekisui XenoTech [62].

If large quantities of a particular organelle or subcellular membrane are required, it may be necessary it is generally impractical to use methods involving density gradient centrifugation steps. In such cases the protocol depicted in Figure 3 can be replaced by one based solely on differential centrifugation. low-speed centrifugation (500 g for 10 min) yields a crude nuclear fraction, medium speed centrifugation (10 000 g for 20 min) yields a crude mitochondrial/peroxisomal fraction, and a final ultracentrifugation step (100 000 g for 60 min) yields a crude microsomal fraction) [63]. As with all such protocols, variations exist [64].

Methods have been published for the large scale isolation of enriched plasma membranes from both plant and mammalian microsomal fractions using an aqueous 2-phase system [65, 66]. Partition in a 2-phase Dextran/PEG system is capable of producing plasma membrane preparations of 85–90 % purity in yields of up to 20%.

A quick review of the literature reveals a seemingly bewildering array of different protocols for subcellular fractionation. However, on closer inspection most are variations on long-established protocols protocols are often fine-tuned for different cell and tissue types.

  • What organelle(s)/cell compartments(s) do I wish to study? One or many?
  • What do I want to use the isolated organelles/compartments for? For example, proteomics/lipidomics or functional studies?
  • How much material do I need? Small amounts for MS analysis or substantial quantities for detailed functional studies?
  • How pure do the organelles/compartments need to be? For quantitative proteomic analysis, the purity of each fraction may be of paramount importance. For functional studies it may often be sufficient to use a relative crude enriched fraction rather than one that is highly purified.

The answers to these questions will help the researcher to decide upon the best subcellular fractionation protocol for their particular needs.

Suspend the plant tissue homogenate in an isotonic medium (0.35 mol/L sodium chloride or 0.4 mol/L sucrose solution) to minimize any damage to the chloroplasts. Centrifuge the homogenate at 1000 rpm for 2 min to remove tissue residues and remaining cells. Then centrifuge at 3000 rpm for 5 min to obtain the chloroplast pellets. Centrifugation should be done at 0

Oui. Centrifugal force does not damage the mitochondrial structure. Besides, the centrifugal buffer has a protective role for mitochondria.


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