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Quelle ADN polymérase peut utiliser une entaille comme site d'amorçage ?

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Quelle ADN polymérase (disponible dans le commerce) peut initier la polymérisation au niveau des entailles, sans amorce standard ?

Mon objectif est d'effectuer une amplification en cercle tournant à partir d'un entaille.


Il semble que vous recherchiez une ADN polymérase capable d'effectuer la traduction des pseudonymes. L'ONE tient à jour un tableau énumérant les propriétés de ses polymérases, y compris pseudo traduction et extension de pseudo. Sans détails supplémentaires, il semble Taq fonctionnerait pour votre but.


ADN complémentaire

En génétique, ADN complémentaire (ADNc) est un ADN synthétisé à partir d'une matrice d'ARN simple brin (par exemple, ARN messager (ARNm) ou microARN (miARN)) dans une réaction catalysée par l'enzyme transcriptase inverse. L'ADNc est souvent utilisé pour cloner des gènes eucaryotes chez les procaryotes. Lorsque les scientifiques souhaitent exprimer une protéine spécifique dans une cellule qui n'exprime normalement pas cette protéine (c'est-à-dire une expression hétérologue), ils transfèrent l'ADNc qui code pour la protéine à la cellule receveuse. En biologie moléculaire, l'ADNc est également généré pour analyser les profils transcriptomiques dans des tissus en vrac, des cellules individuelles ou des noyaux uniques dans des tests tels que les puces à ADN et l'ARN-seq.

L'ADNc est également produit naturellement par les rétrovirus (tels que le VIH-1, le VIH-2, le virus de l'immunodéficience simienne, etc.) puis intégré dans le génome de l'hôte, où il crée un provirus. [1]

Le terme ADNc est également utilisé, généralement dans un contexte bioinformatique, pour désigner une séquence de transcription d'ARNm, exprimée en bases d'ADN (désoxy-GCAT) plutôt qu'en bases d'ARN (GCAU).


ADN polymérases procaryotes

Chez les procaryotes, les ADN pol-I, II et III sont les trois types importants que nous aborderons ci-dessous.

ADN polymérase I

C'est la première enzyme polymérase, découverte par Arthur Kornberg en 1958. Elle se compose d'une seule chaîne polypeptidique. Initialement, on croyait que l'ADN pol-I est une enzyme de réplication. Lors d'une étude plus approfondie, il a été démontré qu'il s'agit davantage d'une enzyme de réparation de l'ADN que d'une enzyme de réplication. Dans pol-I, il y a un atome de zinc présent par chaîne, en raison de laquelle il est également connu sous le nom de "Métalloenzymes”.

Activités de DNA pol-I: Il montre à la fois l'activité des polymérases et des exonucléases.

  • Activité polymérase 5'-3' implique l'ajout de bases nucléotidiques pour la synthèse d'un nouveau brin d'ADN.
  • Activité exonucléase 3'-5' implique la suppression de bases nucléotidiques incompatibles ou aide à la traduction des coupures.
  • Activité exonucléase 5'-3' implique la suppression des amorces d'ARN de l'extrémité 5' du brin d'ADN complémentaire.

Structure: La structure de Pol-I ressemble à la main droite de l'humain. La structure se compose des trois régions suivantes :

  • Région des palmiers: C'est le site actif catalytique possédant des séquences conservées. Il agit comme un site actif de pol-I. La région de la paume est constituée d'une feuille plissée . Sa fonction principale est le traitement de l'ajout de désoxyribonucléotide triphosphate.
  • Région des doigts: C'est le site matrice, où une fois l'appariement des bases effectué, il enferme le désoxyribonucléotide triphosphate. Sa fonction principale est de catalyser la synthèse des nucléotides entrants à l'aide d'un catalyseur connu sous le nom d'ions métalliques.
  • Région du pouce: C'est la région qui lie l'ADN et maintient la position correcte de l'amorce et du site actif.


ADN polymérase II

Thomas Kornberg l'a découvert en 1970. Son efficacité de polymérisation est plus lente que la pol-I. Il se compose également d'une seule chaîne polypeptidique. Pol-II agit comme enzyme de sauvegarde ou alternative au processus de réplication, car en l'absence de pol-I, il peut allonger les fragments d'Okazaki.

Activités de DNA pol-II:

  • Activité polymérase 5'-3' implique l'ajout de bases nucléotidiques pour la synthèse d'un nouveau brin d'ADN.
  • Activité exonucléase 3'-5' implique la suppression de bases nucléotidiques incompatibles ou aide à la traduction des coupures.

Structure: La structure de pol-II est assez inconnue.

ADN polymérase III

C'est l'holoenzyme primaire qui participe principalement au processus de réplication. Il se compose de deux chaînes polypeptidiques. Pol-III contient des sous-unités de nombreuses enzymes qui remplissent différentes fonctions, et également appelées "enzyme hétéromultimère”. Pol-III contient 10 sous-unités dans sa structure qui font de la pol-III une enzyme complète, c'est-à-dire « holoenzyme ».

Activités trouvées dans l'ADN pol-III:

  • Activité polymérase 5'-3' implique l'ajout de bases nucléotidiques pour la synthèse d'un nouveau brin d'ADN.
  • Activité exonucléase 3'-5' implique la suppression de bases nucléotidiques incompatibles ou aide à la traduction des coupures.

Structure: La structure de pol-III se compose de 10 sous-unités, telles que :

  • : Il code le gène de l'ADN E et aide à la synthèse de l'ADN.
  • : Codes pour le gène DNA Q et aide à l'activité de relecture 3'-5'.
  • : code pour le gène hol E, agit comme une protéine accessoire et participe également au mécanisme de relecture.
  • : Il code pour le gène DNA X et favorise la dimérisation du complexe protéique central.
  • : Il code pour le gène ADN Y.
  • : code pour le gène hol A.
  • ’ : Codes pour le gène hol B.
  • : code pour le gène hol C.
  • : codes pour le gène hol D.
  • : code pour le gène N de l'ADN. Il agit comme un pince protéine qui détient la molécule d'ADN et responsable du facteur de processivité. Ƴ, δ, ', et agissent tous comme un complexe clamp loader et aident la protéine -clamp loader à se lier à l'ADN.

Tableau de comparaison entre les fonctions des ADN polymérases procaryotes

PropriétésADN pol-IADN pol IIADN pol-III
Activité polymérase 5'-3'PrésentPrésentPrésent
Activité exonucléase 3'-5'PrésentPrésentPrésent
Activité exonucléase 5'-3'PrésentAbsentAbsent
Polymérisation ARN dépendanteIl peut effectuer une polymérisation dépendante de l'ARNÇa ne peut pasÇa ne peut pas
Caractéristiques de réparation de l'ADNPrésentPrésentAbsent
Propriété de ligaturePrésentAbsentAbsent
Implication dans la réplicationParticipe Ne participe pasJoue un rôle majeur

Caractéristiques

L'ADN-polymérase a des caractéristiques spécifiques comme :

  1. Activité de polymérisation
  2. fidélité, c'est-à-dire capacité de relecture
  3. Processivité, c'est-à-dire le traitement de l'ADN et de ses bases
  4. Thermostabilité, c'est-à-dire stabilité à haute température
    Exemple : Taq-ADN polymérase de Thermes bactérie aquaticus.

Toutes ces propriétés le rendent utile dans les technologies moléculaires telles que la PCR, le séquençage de l'ADN, etc.


Allongement de la réplication

Après le "déclenchement" de l'origine, l'hélicase commence à dérouler l'hélice d'ADN et l'assemblage de la machinerie de réplication se produit. Là où l'hélicase se déroule, l'hélice d'ADN est appelée le fourche de réplication . Les protéines suivantes sont impliquées dans la réplication de l'ADN et seront discutées dans cette section : Hélicase, ADN primase, ADN polymérases α, et , PCNA, FEN-1 et RNase H2.

Les ADN polymérases sont incapables de produire un nouveau brin d'ADN sans une courte séquence d'acide nucléique appelée amorce qui peut fournir un groupe 3'-hydroxyle libre. Alternativement, pendant la transcription, les ARN polymérases peuvent se lier à des molécules d'ADN simple brin, « lire » la séquence d'ADN et commencer immédiatement à construire une molécule d'ARN. Parce que les ARN polymérases peuvent synthétiser des acides nucléiques de novo une ARN polymérase appelée ADN primase lie l'ADN simple brin et ajoute un court (

35 nt) Séquence d'ARN sur les deux brins d'ADN matrice de chaque côté de l'origine de réplication (Figure 14-2 A & B). Ensuite, les ADN polymérases peuvent commencer la synthèse de molécules d'ADN (Figure 14-2 B). Trois ADN polymérases majeures sont alors impliquées : α, δ et ε. L'ADN pol ajoute un court fragment d'ADN (20 à 30 nts) à l'amorce d'ARN sur les deux brins, puis transmet la synthèse à une seconde polymérase, soit l'ADN pol ou l'ADN pol ε. Une protéine appelée Antigène nucléaire cellulaire proliférant (PCNA) se « serre » autour de l'ADN et interagit avec la polymérase pour aider à stabiliser et à maintenir l'interaction de la polymérase avec l'ADN. La réplication de l'ADN se déroulera dans les deux sens, loin de l'origine.

Figure 14-2 : Début de la réplication de l'ADN. (A) Une fois que l'hélicase (triangle violet) commence à dérouler l'ADN à l'origine, l'ADN primase (boîte rose) peut reconnaître l'ADN simple brin et commencer à ajouter une courte amorce d'ARN (illustrée en B). Notez qu'il est estimé que l'ADN primase ajoutera environ 35 nucléotides d'ARN. Cette illustration représente cet ajout en utilisant seulement 2 nucléotides (agrafe rose-chaque ligne verticale correspond à un nucléotide). L'ADN polymérase (en bleu) ajoutera des nucléotides à l'extrémité 3'-OH de l'amorce, puis « transmettra » la polymérisation à l'ADN polymérase δ ou à l'ADN polymérase ε. La polymérisation se produira sur le brin fille dans la direction 5 'à 3'. Sur le brin parental supérieur, cela signifie que la polymérisation se produira de droite à gauche et sur le brin parental inférieur, elle se produira de gauche à droite. Le PCNA (anneau orange) est une protéine qui aide à maintenir l'ADN polymérase associée à la matrice d'ADN. (Illustration de Christopher G. Brown)

Notez dans la figure 14-2B que toutes les ADN polymérases se lient au groupe 3'-OH sur l'amorce d'ARN pour initier la réplication de l'ADN.

Au fur et à mesure que les ADN polymérases s'allongent à partir de l'amorce d'ARN (Figure 14-3), vous remarquerez que les ADN polymérases qui sont d'un bleu plus foncé peuvent répliquer les brins filles sans « heurter » une autre structure. Tant que l'hélicase continue de dérouler l'hélice d'ADN, ce complexe de polymérase peut se dérouler dans le sens 5 'à 3' sans s'arrêter. Les brins filles qui sont synthétisés dans la même direction que la fourche de réplication progresse sont fabriqués de manière continue et sont appelés brins principaux . Alternativement, les ADN polymérases représentées par la couleur bleue plus claire "se heurteront" à l'amorce d'ARN précédente. Ces brins filles sont toujours répliqués de 5 'à 3', mais ils ne sont pas répliqués dans la même direction que la fourche de réplication qui leur est la plus proche ET ils sont répliqués en fragments plus courts. Ce brin fille est appelé le brin en retard .

Figure 14-3 : Allongement de la réplication de l'ADN, partie 2 . Les ADN polymérases en bleu foncé (α et ε) répliquent l'ADN dans la même direction que la fourche de réplication se déplace, appelée synthèse du brin principal. Les ADN polymérases en bleu clair (α et δ) répliquent l'ADN loin de leur fourche de réplication la plus proche en fragments courts, appelés synthèse de brins retardés. Les polymérases à brins en retard vont « cogner » dans les amorces d'ARN voisines. Remarquez le retour de l'ADN primase (boîte rose), qui doit revenir au brin retardé pour déposer une nouvelle amorce afin qu'un nouveau 3'OH soit disponible pour la réplication. (Illustration de Christopher G. Brown)

Une fois que le complexe de polymérase à brin retardé « heurte » la molécule d'ARN voisine, il commencera à déplacer le voisin en « épluchant » les nucléotides et en répliquant cette partie de l'ADN (Figure 14-4 A). Le décollement provoque la formation d'un petit « rabat », des enzymes spéciales appelées endonucléases de rabat entrent et coupent le squelette phosphodiester près de la limite ARN/ADN. Les deux enzymes considérées comme les plus responsables de cette action sont appelées RNase H2 et FEN-1 (endonucléase lambeau 1). Une fois le rabat retiré, les polymérases à brins en retard rempliront toute séquence d'ADN restante. Il se dissociera ensuite de l'ADN, laissant une «entaille» dans le squelette de l'ADN. Une enzyme appelée ADN ligase se liera et connectera chimiquement le 3'-OH libre avec le groupe 5'-phosphate libre "scellant" le squelette (Figure 14-4 B).

Figure 14-4 : Processus d'élimination des amorces d'ARN et de ligature des brins d'ADN. (A) Les ADN polymérases à brin retardé se heurteront aux amorces d'ARN voisines, les déplaceront et les endonucléases à volet (RNase H2 et FEN-1-teal PacMan™) les élimineront. Les ADN polymérases répliqueront tous les nucléotides restants, puis se dissocieront de l'ADN en laissant un squelette entaillé. (B) L'ADN ligase (montrée en beige) connectera les groupes libres 3'-hydroxyle et 5'-phosphate fixant le squelette brisé. Les courts fragments d'ARN/ADN générés sur le brin retardé sont appelés fragments d'Okazaki. (Illustration de Christopher G. Brown)

En répétant ce processus sur le brin retardé, les petits fragments d'ARN/ADN (appelés Fragments d'Okazaki ) sont reconstitués pour créer un long brin fille d'ADN exempt de tout nucléotide d'ARN (Figure 14-5).

À la fin de la phase S, la cellule aura complètement et fidèlement répliqué l'ensemble du génome. Considérons un seul chromosome un instant. Avant la phase S, un chromosome unique est constitué de deux brins d'ADN, maintenus ensemble par des liaisons hydrogène dans une seule hélice d'ADN. À la fin de la phase S, le chromosome se compose de quatre brins d'ADN qui sont répartis uniformément entre deux structures identiques appelées chromatides. Parce que les chromatides sont identiques, elles sont appelées chromatides sœurs. Comment ces sœurs sont-elles réellement liées ? Ils ne sont pas liés entre eux par de l'hydrogène comme les hélices individuelles, mais plutôt par une protéine spéciale appelée cohésion littéralement « lien » les deux chromatides sœurs ensemble. La cohésine reste liée aux deux chromatides sœurs jusqu'à la phase M où une enzyme spéciale appelée séparer le dégrade, permettant aux sœurs de se séparer. Pour plus d'informations, reportez-vous au chapitre 13.

Figure 14-5 : Élimination répétée des amorces d'ARN et action de la ligase. (A) Le cycle de la figure 14-4 continue jusqu'à ce que les deux brins parentaux d'ADN aient été répliqués. (B) Remarquez que ce processus se poursuit, le brin fille devient un long morceau d'ADN. Les amorces d'ARN finales aux extrémités du brin retardé seront supprimées dans un processus différent (non discuté ici). (Illustration de Christopher G. Brown)

La structuration épigénétique est conservée après la réplication

Des groupes méthyle peuvent être ajoutés aux nucléotides de cytosine comme mécanisme de contrôle des gènes qui sont transcrits dans les cellules, une forme de structuration épigénétique. Ceci est souvent important dans l'identité et le bon fonctionnement de la cellule. Par conséquent, il est important de s'assurer que toute structuration épigénétique est conservée après la réplication dans le brin fille. Parce que les cytosines dans les brins parentaux conserveront toute méthylation, les ADN méthyltransférases qui reconnaissent la méthylation du brin parental seront capables de méthyler les cytosines appropriées dans le brin fille. Référez-vous à la figure 5-8 du chapitre 5 pour relier ces idées.

Erreurs dans la réplication de l'ADN et la relecture

La réplication de l'ADN est un processus très précis, mais des erreurs peuvent parfois se produire, telles qu'une ADN polymérase insérant une mauvaise base.

La plupart des erreurs lors de la réplication de l'ADN sont rapidement corrigées par la capacité de relecture de l'ADN polymérase elle-même (Figure 14-6). En relecture, l'ADN pol ou ε lit la base nouvellement ajoutée avant d'ajouter la suivante, une correction peut donc être apportée. La polymérase vérifie si la base nouvellement ajoutée s'est correctement appariée avec la base du brin modèle. S'il s'agit de la bonne base, le nucléotide suivant est ajouté. Si une base incorrecte a été ajoutée, l'enzyme coupe la liaison phosphodiester et libère le mauvais nucléotide sur le brin fille. Ceci est réalisé par l'action exonucléase 3' de l'ADN pol ou ε. Une fois le nucléotide incorrect supprimé, il peut être remplacé par le bon. Notez que l'ADN pol n'a pas de capacité de relecture car il ne contient pas l'activité exonucléase 3'.

Figure 14-6 : Relecture par ADN polymérase. Les ADN polymérases delta et epsilon contiennent une enzyme exonucléase 3' à 5' qui permet l'élimination des nucléotides mal appariés (nt). L'enzyme reconnaît le mésappariement, ralentit pour permettre à l'exonucléase 3' à 5' d'interagir avec le nt mal apparié. Il clive l'épine dorsale du brin fille pour éliminer la mauvaise base, puis la machine de réplication 5 'à 3' ajoute le nucléotide correct. (Illustration de Jennell Talley.)


Quelle ADN polymérase peut utiliser une entaille comme site d'amorçage ? - La biologie

La réplication de l'ADN est un processus semi-conservateur qui se produit pendant la phase S de l'interphase. C'est le processus par lequel l'ADN d'un organisme est répliqué pour produire deux copies identiques.

Il commence à l'origine de la réplication. Les procaryotes ont une origine de réplication, alors que les eucaryotes en ont plusieurs. A chaque origine de réplication, il y a une bulle de réplication qui contient deux fourches de réplication. À chaque fourche de réplication se trouve l'enzyme ADN hélicase qui déroule la structure en double hélice de l'ADN. Pour ce faire, il rompt les liaisons hydrogène entre les bases azotées, séparant les deux brins d'ADN. Les protéines de liaison simple brin empêchent les brins séparés de se rattacher à la fourche de réplication. Les deux brins d'ADN séparés sont maintenant appelés brins matrices.

L'ADN polymérase III est l'enzyme utilisée pour construire un brin d'ADN complémentaire à l'aide d'un brin matrice. Il le fait en attachant des nucléosides triphosphates à l'extrémité 3' d'un nucléotide. L'ADN polymérase III garantit également que les nucléotides attachés ont des bases complémentaires au brin matrice. Cependant, l'ADN polymérase III ne peut pas ajouter de nucléotides au brin matrice. Ainsi, l'ARN primase crée des amorces d'ARN : de courtes séquences d'ARN qui sont complémentaires du brin matrice d'ADN. L'ADN polymérase III a alors des extrémités 3' disponibles auxquelles ajouter des nucléotides. Cependant, l'ADN polymérase III ne peut le faire que dans une direction 5 'à 3'.

L'ADN est antiparallèle, c'est-à-dire que chaque brin va dans la direction opposée (comme le montre le schéma ci-dessous).

Pour cette raison, les deux brins du gabarit sont également dans des directions différentes. Dans le schéma ci-dessus, le brin de droite serait le brin principal. Cela signifie qu'une fois qu'une amorce d'ARN est placée à l'extrémité 3 'de ce brin, l'ADN polymérase peut construire son brin complémentaire en continu dans une direction 5' à 3'.

Le brin à droite du diagramme est le brin en retard. Le brin retardé semble croître dans une direction de 3' à 5', mais ce n'est pas le cas. Le brin retardé est divisé en segments appelés fragments d'Okazaki qui sont construits individuellement dans une direction 5 'à 3' par l'ADN polymérase III. Chaque fragment commence par une amorce d'ARN. Au fur et à mesure que l'hélicase décompresse la double hélice d'ADN, de plus en plus d'amorces sont ajoutées.

D'autres enzymes sont également impliquées dans la réplication de l'ADN. L'ADN polymérase I supprime les amorces d'ARN et les remplace par des nucléotides d'ADN. L'ADN ligase forme des liaisons phosphodiester entre les nucléotides d'ADN que l'ADN polymérase I ajoute et les extrémités des fragments d'Okazaki. Enfin, les enzymes relisent les brins d'ADN pour vérifier les erreurs, empêchant ainsi les mutations.

7.1.1 Les nucléosomes aident à surenrouler l'ADN.

Les nucléosomes aident également à réguler l'expression des gènes. Une partie de l'ADN est enroulée autour des histones dans le nucléosome et n'est pas accessible par l'ARN polymérase, elle ne peut donc pas être transcrite

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7.1.2 La structure de l'ADN suggère un mécanisme de réplication de l'ADN.

L'ADN est double brin et les deux brins sont reliés par un appariement de bases complémentaires. Par conséquent, il va de soi que lors de la réplication, les deux brins se séparent, puis, par le biais d'un appariement de bases complémentaires, des nucléotides rejoignent les brins séparés. Et cela ferait 2 nouveaux brins d'ADN identiques.

7.1.3 Les ADN polymérases ne peuvent ajouter des nucléotides qu'à l'extrémité 3' d'une amorce.

L'ADN polymérase ne peut pas ajouter de liaisons au phosphate à l'extrémité 5' de l'ADN, elle crée donc des liaisons à l'extrémité 3'.

7.1.4 La réplication de l'ADN est continue sur le brin avant et discontinue sur le brin arrière.

La réplication de l'ADN se produit sur les deux brins de l'ADN, un brin est appelé le brin principal et l'autre est appelé le brin retardé. Le brin principal est celui qui se déplace dans une direction de 3' à 5' de la même manière que l'hélicase.

7.1.5 La réplication de l'ADN est réalisée par un système complexe d'enzymes.

ADN polymérase III - catalyse la réaction qui lie les nucléotides flottants libres pour former un nouveau brin d'ADN

Hélicase - Sépare les brins d'ADN d'origine

Gyrase/Topoisomérase - Aide à dérouler l'hélice d'ADN

ADN Primase - Fournit un site appelé primase pour l'ADN polymérase III pour commencer à ajouter des nucléotides.

ADN polymérase I - Remplace l'amorce d'ARN par de l'ADN

Protéines de liaison simple brin - Empêche l'ADN de se re-hybrider

Ligase - Rejoint les fragments d'okazaki ensemble

7.1.6 Certaines régions de l'ADN ne codent pas pour des protéines mais ont d'autres fonctions importantes.

L'ADN qui ne code pas pour une protéine est appelé séquence non codante. Certaines séquences non codantes ont des fonctions importantes telles que la régulation de l'expression des gènes en favorisant et en réprimant la transcription des gènes adjacents.

De plus, de nombreuses séquences codantes d'ADN sont interrompues par des séquences non codantes appelées introns. Les introns sont supprimés avant la traduction mais ils sont importants dans le traitement de l'ARNm

Aux extrémités des chromosomes se trouvent des séquences non codantes appelées télomères. Pendant la réplication de l'ADN, l'extrémité de la molécule ne peut pas être répliquée, de sorte que les télomères protègent des parties de l'ADN contre la perte pendant la réplication

Enfin, certaines séquences non codantes codent pour des molécules d'ARNt au lieu d'une protéine.


7.1.7 Enquête de Rosalind Franklin et Maurice Wilkins sur la structure de l'ADN par diffraction des rayons X.

En 1950, Marice Wilkins a développé une méthode de production d'un moyen d'imagerie d'une molécule d'ADN par diffraction des rayons X. Rosalind Franklin a travaillé dans le même laboratoire que Wilkins et a développé un détecteur haute résolution qui prenait des images très claires de l'ADN. Ses découvertes ont été essentielles dans la découverte de la double hélice par Crick et Watson

7.1.8 Utilisation de nucléotides contenant de l'acide didésoxyribonucléique pour arrêter la réplication de l'ADN lors de la préparation d'échantillons pour le séquençage des bases.

Le séquençage de l'ADN est un processus par lequel l'ordre des nucléotides dans l'ADN peut être trouvé. L'une des étapes préliminaires du séquençage de l'ADN consiste à fragmenter l'ADN en morceaux. Pour ce faire, on ajoute du ddNA (acide didésoxyribonucléique) qui n'a pas de molécule OH à l'extrémité 3' du sucre ribose, cela signifie que lorsque l'ADN polymérase atteint le ddNA, elle ne peut pas continuer à se répliquer.

L'électrophorèse sur gel est le processus par lequel la séquence de l'ADN est trouvée. L'ADN fragmenté est placé dans un gel et un courant électrique le traverse. L'ADN est une molécule polaire et est affecté par le courant électrique et descend le gel. Les fragments plus légers/plus petits de l'ADN se déplacent plus loin tandis que les fragments plus lourds/plus longs se déplacent très peu. Le résultat est un modèle de bandes que l'on peut utiliser pour déterminer la séquence de l'ADN. Mais rappelez-vous que la séquence du brin d'origine est complémentaire à celle montrée par les motifs de bandes puisque l'ADN s'est répliqué.


7.1.9 Les répétitions en tandem sont utilisées dans le profilage de l'ADN.

Une répétition en tandem à nombre variable (VNTR) est une courte séquence de nucléotides qui peut être utilisée pour créer le profil d'une personne en fonction du nombre de répétitions de la séquence. Le VNTR se trouve au même locus (emplacement sur le chromosome) chez différentes personnes, ce qui le rend relativement simple à trouver. Le profilage ADN peut être utilisé pour résoudre des affaires pénales et résoudre des différends parentaux, entre autres


7.1.10 Analyse des résultats de l'expérience Hershey et Chase fournissant la preuve que l'ADN est le matériel génétique.

Hershey et Chase ont mené une expérience pour voir si les protéines ou l'ADN étaient le matériel génétique de la cellule. Pour ce faire, ils ont infecté une bactérie E.coli avec le virus du phage T2. Les virus sont constitués uniquement d'ADN à l'intérieur d'une enveloppe protéique, il n'y avait donc pas d'autres variables dans le mélange.

L'ADN contient du phosphore mais pas du soufre, et les protéines peuvent contenir du soufre mais pas du phosphore. Cette distinction a été utilisée dans l'expérience utilisant des isotopes (différentes formes) de soufre et de phosphore. Ils ont fabriqué deux souches de bactéries du phage T2, une avec un isotope de phosphore plus lourd dans l'ADN et une avec un isotope de soufre plus lourd dans les protéines. Ils l'ont fait en mettant le phage T2 dans une solution avec tout le nécessaire pour se répliquer et uniquement la version la plus lourde du soufre ou la version la plus lourde du phosphore. Après que le phage T2 se soit répliqué plusieurs fois, il serait principalement constitué de l'isotope le plus lourd

Hershey et Chase ont poussé le virus du phage T2 à injecter son matériel génétique dans la bactérie E. Coli. Et puis ils ont mis cette E. Coli dans un tube à essai et ont mis ce tube à essai dans une centrifugeuse pour le faire tourner très rapidement en cercle. En raison du mouvement circulaire rapide, les parties les plus lourdes de l'E. Coli se sont déplacées vers le fond du tube à essai tandis que les isotopes les plus légers étaient au sommet.

Lorsque la souche de soufre a injecté son matériel génétique, le pourcentage d'isotopes lourds par rapport aux isotopes légers était négligeable. Cependant, lorsque la souche phosphorée du virus a injecté son matériel génétique dans la bactérie, 65 % de l'ADN de l'E. Coli était de l'isotope lourd d'après les résultats de la centrifugation.


Discussion

Grâce à l'utilisation de la technologie de séquençage de nouvelle génération, la présente étude a évalué la préférence de la polymérase en observant directement l'efficacité d'amorçage de toutes les amorces hexamères possibles. La structure cristalline de catalytiquement actif Bacillus stearothermophilus Les cristaux d'ADN polymérase indiquent qu'environ dix pb d'ADN duplex amorce:matrice et quatre nucléotides de matrice devant la jonction matrice d'amorce occupent le site de liaison à l'ADN de la polymérase pendant la synthèse [7, 9]. De plus, la structure révèle une transition de l'ADN de la forme A vers la forme B dans les six bps adjacentes à la jonction amorce:matrice. La tendance d'une séquence nucléotidique donnée vers la conformation A ou B est un facteur clé dans de nombreuses interactions protéine-ADN [10, 11]. Par exemple, lorsque la protéine réceptrice AMP cyclique se lie, l'ADN subit une transition de type B vers A, et la liaison est plus forte lorsque la partie centrale de l'ADN est sous la forme A [12]. De manière analogue aux ADN polymérases, l'hétéroduplex ARN-ADN formé transitoirement au cours de la transcription [13] et l'ADN dans les centres actifs de la transcriptase inverse du VIH-1 [14] sont également sous la forme A. Il a été suggéré que la stabilisation de la forme A peut être critique pour augmenter la fidélité de la synthèse d'ADN et d'ARN [15]. Dans cette étude, nous avons observé que les deux paires de bases situées à la jonction amorce:matrice contenaient une teneur élevée en GC dans des séquences préférentiellement amplifiées. Plusieurs auteurs ont démontré que poly (dG)-poly (dC) subit la transition de la forme B vers A de plus facilement que poly (dA)-poly (dT), qui a tendance à résister à la transition B vers A [12, 16] . En effet, l'énergie libre de Gibb pour la transition B vers A pour les motifs trimériques riches en GC est inférieure à la transition de motifs de séquences riches en AT similaires [16]. Il est raisonnable de considérer qu'une interaction amorce:matrice qui a tendance à être de la forme A ou une interaction amorce:matrice qui peut être plus facilement conformée à la forme A est préférentiellement liée par l'ADN polymérase, entraînant finalement une amplification biaisée .

Le but de la présente étude était de démontrer et de définir le biais d'amorçage dépendant de l'ADN polymérase. Un biais d'amplification positif vers l'augmentation de la teneur en GC a été observé pour les six paires de bases d'interaction amorce:matrice pour toutes les ADN polymérases commerciales testées, et plusieurs motifs de séquence préférentiellement amplifiés ont été identifiés. Fait intéressant, Dabney et al. ont constaté que certaines polymérases couramment utilisées biaisent fortement contre l'amplification de l'ADN endogène en faveur d'une contamination microbienne riche en GC [5]. Dans leur étude, Phusion HF et AmpliTaq Gold ont montré un biais très prononcé envers les molécules avec >50% GC. Une autre étude de Hansen et al. ont démontré que l'amorçage aléatoire d'hexamères lors de la génération d'ADNc induit des biais au début des lectures de séquençage de nucléotides. Dans leur étude, ils ont tenté de discerner si les lectures de séquençage à haut débit provenaient du brin sens par synthèse du deuxième brin (à partir de l'ADN polymérase) ou du brin antisens par synthèse du premier brin (à partir de la transcriptase inverse) [6]. Étant donné que les deux brins présentaient un modèle de biais similaire, ils ont conclu que la synthèse d'ADN du deuxième brin est probablement amorcée par les hexamères aléatoires restants dans la solution. Ils ont également noté de légères différences dans les motifs des brins sens et antisens qu'ils ont attribués à différentes spécificités de séquence de la transcriptase inverse et de l'ADN polymérase ou à l'effet de l'amorçage [6]. Nos données sont en accord avec leur conclusion et suggèrent qu'une majorité du biais est probablement due à l'amorçage par les hexamères aléatoires et à la préférence de l'ADN polymérase pour certaines jonctions amorce/matrice. La transcriptase inverse peut également avoir des motifs de séquence préférentiels car l'hétéroduplex ARN-ADN dans le centre actif de la transcriptase inverse du VIH-1 [14] est de la forme A. Cependant, le biais de la transcriptase inverse n'a pas été traité dans les expériences actuellement décrites.

Dans notre étude, les quatre paires de bases de la matrice d'ADN simple brin immédiatement après la jonction, que nous avons appelée la « piste », étaient également intéressantes car la polymérase peut interagir directement avec les bases exposées de la matrice simple brin. Cette interaction peut affecter l'amplification. Par exemple, dans les ADN polymérases de la famille des archées B, l'ADN polymérase possède une fonction de lecture anticipée dans laquelle la polymérisation s'arrêtera si un uracile est rencontré 4 paires de bases avant la jonction amorce: modèle [17, 18]. Ceci n'est pas observé avec les ADN polymérases de la famille A. Les séquences de piste dans les expériences décrites n'avaient pas de tendance clairement définie en ce qui concerne le contenu en GC comme l'interaction amorce:modèle. Cependant, un certain degré de biais était évident et nous avons pu identifier des motifs de séquence qui étaient préférentiellement amplifiés. Cela suggère que lors de l'amplification de cibles avec des amorces universelles, comme dans le cas de certaines réactions de PCR multiplex, il faut veiller à ce que la jonction amorce-matrice soit similaire pour toutes les cibles. Si la jonction amorce:matrice varie en amont de la jonction, cela peut avoir pour résultat que l'ADN polymérase amplifie préférentiellement les jonctions amorce:matrice "favorables" par rapport aux autres.

Dans ce travail, toutes les expériences ont été réalisées en utilisant directement les systèmes de tampon polymérase des fabricants. La modification des conditions du tampon peut influencer la configuration de l'enzyme et/ou de l'ADN et obtenir une amplification réussie. Cependant, cet effort de conception post-amorce peut être évité en ajustant légèrement la position de l'amorce pendant la phase de conception initiale. Ceci est particulièrement utile lors de la conception d'amorces pour des réactions multiplex où l'équilibrage inter-loci est nécessaire pour réduire les conflits entre les amorces et les cibles. Lors de la conception d'amorces pour les réactions multiplex, le logiciel iC-Architect peut être utilisé pour sélectionner des amorces directes et inverses de valeurs PPI relativement élevées et similaires pour plusieurs cibles ou pour éviter les régions avec des valeurs PPI très faibles. En fin de compte, le logiciel identifie les amorces avec des motifs préférés à l'extrémité 3 'de l'amorce, qui peuvent être utilisées pour augmenter les taux de réussite de la PCR, en particulier lorsqu'elles sont utilisées conjointement avec Tm des mesures.


ADN polymérase phi29

Les réactifs suivants sont fournis avec ce produit :

ADN polymérase phi29 M0269SVIAL -20 1 x 0,025 ml 10 000 unités/ml
Tampon de réaction ADN polymérase phi29 B0269SVIAL -20 1x1,5 ml 10 fois
Albumine recombinante, grade biologie moléculaire B9200SVIAL -20 1 x 0,6 ml 20 mg/ml
ADN polymérase phi29 M0269LVIAL -20 1 x 0,125 ml 10 000 unités/ml
Tampon de réaction ADN polymérase phi29 B0269SVIAL -20 1x1,5 ml 10 fois
Albumine recombinante, grade biologie moléculaire B9200SVIAL -20 1 x 0,6 ml 20 mg/ml

Fonctionnalités de l'application

  • Réplication nécessitant un haut degré de déplacement de brin et/ou de synthèse processive
  • Réplication haute fidélité à températures modérées

Définition de l'unité

Conditions de réaction

1X tampon de réaction ADN polymérase phi29
Supplément avec BSA purifié
Incuber à 30°C

1X tampon de réaction ADN polymérase phi29
50 mM de Tris-HCl
10 mM de MgCl2
10 mM (NH4)2DONC4
TNT 4 mM
(pH 7.5 @ 25°C)

Storage Buffer

10 mM Tris-HCl
100 mM KCl
TNT 1 mM
0.1 mM EDTA
50% Glycerol
0.5% Tween® 20
0.5% IGEPAL® CA-630
pH 7.4 @ 25°C

Heat Inactivation

Masse moléculaire

5' - 3' Exonuclease

3' - 5' Exonuclease

Strand Displacement

Unit Assay Conditions

Companion Products

Materials Sold Separately

  1. The presence of active reducing reagent in the reaction buffer is critical for this enzyme. While the reaction buffer supplied with the enzyme contains DTT, older buffer stocks or stocks that have been repeatedly frozen and thawed should be supplemented with 4 mM DTT to obtain maximal activity.
  2. If stock solutions of lesser concentration are needed, use Diluent F (NEB #B8006).
  1. Blanco, L. and Salas, M. (1984). Proc. Natl. Acad. Sci. Etats-Unis. 81, 5325-5329.
  2. Blanco. L., et al. (1989). J. Biol. Chem.. 264, 8935-8940.
  3. Garmendia, C., et al. (1992). J. Biol. Chem.. 267, 2594-2599.

Product Citation Tool

Caractéristiques

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New England Biolabs (NEB) is committed to practicing ethical science &ndash we believe it is our job as researchers to ask the important questions that when answered will help preserve our quality of life and the world that we live in. However, this research should always be done in safe and ethical manner. Apprendre encore plus.

Licenses

Trademarks

THERMOPOL ® is a registered trademark of New England Biolabs, Inc.

IGEPAL ® is a registered trademark of Rhodia Operations.
TWEEN ® is a registered trademark of Uniqema Americas, LLC.


Steps in DNA Replication

The process of DNA replication is a complex one, and involves a set of proteins and enzymes that collectively assemble nucleotides in the predetermined sequence. In response to the molecular cues received during cell division, these molecules initiate DNA replication, and synthesize two new strands using the existing strands as templates. Each of the two resultant, identical DNA molecules is composed of one old and one new strand of DNA. Hence the process of DNA replication is said to be a semi-conservative one.

The series of events that occur during prokaryotic DNA replication have been explained below.

Initiation

DNA replication begins at specific site termed as origin of replication, which has a specific sequence that can be recognized by initiator proteins called DnaA. They bind to the DNA molecule at the origin sites, thus flagging it for the docking of other proteins and enzymes essential for DNA replication. An enzyme called helicase is recruited to the site for unwinding the helices into single strands.

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Helicases break the hydrogen bonds between base pairs, in an energy-dependent manner. This point or region of DNA is now known as the replication fork. Once the helices are unwound, proteins called single-strand binding proteins (SSB) bind to the unwound regions, and prevent them for annealing. The replication process thus initiates, and the replication forks proceed in two opposite directions along the DNA molecule.

Primer Synthesis

The synthesis of a new, complementary strand of DNA using the existing strand as a template is brought about by enzymes known as DNA polymerases. In addition to replication they also play an important role in DNA repair and recombination.

However, DNA polymerases cannot start DNA synthesis independently, and require and 3′ hydroxyl group to start the addition of complementary nucleotides. This is provided by an enzyme called DNA primase which is a type of DNA-dependent RNA polymerase. It synthesizes a short stretch of RNA onto the existing DNA strands. This short segment is called a primer, and comprises 9-12 nucleotides. This gives DNA polymerase the required platform to begin copying a DNA strand. Once the primers are formed on both the strands, DNA polymerases can extend these primers into new DNA strands.

The unwinding of DNA may cause supercoiling in the regions following the fork. These DNA supercoils are relaxed by specialized enzyme called topoisomerase which binds to the DNA stretch ahead of the replication fork. It creates a nick in the DNA strand in order to relieve the supercoil.

Leading Strand Synthesis

DNA polymerases can add new nucleotides only to the 3′ end of an existing strand, and hence can synthesize DNA in 5′ → 3′ direction only. But the DNA strands run in opposite directions, and hence the synthesis of DNA on one strand can occur continuously. This is known as the leading strand.

Here, DNA polymerase III (DNA pol III) recognizes the 3′ OH end of the RNA primer, and adds new complementary nucleotides. As the replication fork progresses, new nucleotides are added in a continuous manner, thus generating the new strand.

Lagging Strand Synthesis

On the opposite strand, DNA is synthesized in a discontinuous manner by generating a series small fragments of new DNA in the 5′ → 3′ direction. These fragments are called Okazaki fragments, which are later joined to form a continuous chain of nucleotides. This strand is known as the lagging strand since the process of DNA synthesis on this strand proceeds at a lower rate.

Here, the primase adds primers at several places along the unwound strand. DNA pol III extends the primer by adding new nucleotides, and falls off when it encounters the previously formed fragment. Thus, it needs to release the DNA strand, and slide further up-stream to start the extension of another RNA primer. A sliding clamp holds the DNA in its place as it moves through the replication process.

Primer Removal

Although new DNA strands have been synthesized the RNA primers present on the newly formed strands need to be replaced by DNA. This activity is performed by the enzyme DNA polymerase I (DNA pol I). It specifically removes the RNA primers via its 5′ → 3′ exonuclease activity, and replaces them with new deoxyribonucleotides by the 5′ → 3′ DNA polymerase activity.

Ligation

After primer removal is completed the lagging strand still contains gaps or nicks between the adjacent Okazaki fragments. The enzyme ligase identifies and seals these nicks by creating a phosphodiester bond between the 5′ phosphate and 3′ hydroxyl groups of adjacent fragments.

Résiliation

This replication machinery halts at specific termination sites which comprise a unique nucleotide sequence. This sequence is identified by specialized proteins called tus which bind onto these sites, thus physically blocking the path of helicase. When helicase encounters the tus protein it falls off along with the nearby single-strand binding proteins.

Fact File

The DNA replication process is almost error free with the help of 3′ → 5′ exonuclease activity of the DNA polymerases. DNA pol III proofreads the nucleotides being newly added to the strand. If a nucleotide has been incorrectly added, DNA pol III recognizes the error immediately, removes the incorrect base, adds the correct nucleotide, and then continues ahead.

Difference Between Prokaryotic and Eukaryotic DNA Replication

Although the basic mechanism remains the same, eukaryotic DNA replication is much more complex, and involves a higher number of proteins and enzymes. The regulatory mechanisms for DNA replication are also more evolved and intricate.

  • In prokaryotes, DNA replication is the first step of cell division. On the other hand, eukaryotic DNA replication is intricately controlled by the cell cycle regulators, and the process takes place during the ‘S’ or synthesis phase of the cell cycle.
  • Unlike prokaryotic DNA, the eukaryotic DNA is always present in combination with histone proteins that are involved in regulation of gene expression. During replication, these proteins need to be removed just before the unwinding of DNA.
  • Owing to higher genomic size and complexity of eukaryotes, several origin and termination sites for replication are present along the DNA. The region between one set of origin and termination sites is called a replication unit or replicon, within which one event of replication takes place. This enables faster and more accurate DNA replication as compared to the prokaryotic system of having a single replicon.
  • The Okazaki fragments formed in prokaryotes are longer as compared to those in eukaryotes. Dans Escherichia coli (E. coli) they are about 1000 to 2000 nucleotides long whereas in eukaryotes their length ranges between 100 and 200 nucleotides.
  • Another interesting difference in prokaryotic and eukaryotic DNA replication is in the termination step of replication. In prokaryotes, the two replication forks, moving in opposite directions along the circular DNA molecule, meet at the termination site, and replication halts. However, eukaryotic DNA being a linear molecule, the lagging strand is shorter than the template strand. To avoid the loss of genetic information through such shortening, chromosomal ends have a set of repetitive sequences called telomeres that comprise noncoding DNA.

Fact File

The human DNA is copied at about 50 base pairs per second. Due to initiation of replication at multiple locations, the process is completed within one hour. If this were not the case, it would take about a month to finish replicating a single chromosome!

The genes of an organism contain all the necessary information to synthesize the right molecule, in the right amounts, and at the right time. Replication is the way to ensure that this coded information is passed down to every cell of the body, and also to the successive generations. After all, as rightly pointed by Richard Dawkins:

“They are the replicators and we are their survival machines. When we have served our purpose we are cast aside. But genes are denizens of geological time: genes are forever.”

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DNA replication is bidirectional and discontinuous explain your understanding of those concepts.

What are Okazaki fragments and how they are formed?

If the rate of replication in a particular prokaryote is 900 nucleotides per second, how long would it take 1.2 million base pair genomes to make two copies?

Explain the events taking place at the replication fork. If the gene for helicase is mutated, what part of replication will be affected?

What is the role of a primer in DNA replication? What would happen if you forgot to add a primer in a tube containing the reaction mix for a DNA sequencing reaction?


Voir la vidéo: Amorçage (Juin 2022).


Commentaires:

  1. Gugis

    Cette version n'est plus à jour

  2. Zola

    Je suis définitif, je suis désolé, mais il ne m'approche absolument pas.

  3. Benen

    Excusez, je vous interromps, mais il me faut un peu plus d'informations.

  4. Tojagami

    Je voudrais vous encourager à visiter un site qui a beaucoup d'informations sur ce sujet.

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    Je trouve que vous admettez l'erreur. Je propose d'examiner.



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