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La streptavidine peut-elle être conjuguée avec des carboxylates activés par EDC ?

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Récemment, j'ai mené une expérience pour conjuguer des oligonucléotides modifiés par une amine avec des particules d'hydrogel ayant des groupes carboxyle. Cependant, la fluorescence (provenant de l'hybridation FAM-ADN) n'apparaît que sur une petite zone de la particule et sa forme est aussi mal définie, comme dans l'image ci-dessous.

Mon conseiller a dit que "L'ADN est une charge négative et le groupe carboxyle a également une charge négative, il n'y a donc aucune possibilité de conjugaison, de conjugaison de streptavidine à une particule, de fixation d'ADN biotinylé et de procéder à l'hybridation".

Cependant, la conjugaison utilisant NHS / EDC nécessite à la fois un groupe amine et un groupe carboxyle. La streptavidine possède-t-elle les groupes chimiques requis pour effectuer une telle conjugaison ? La streptavidine est la 85878 de Sigma Aldrich (Streptavidine de Streptomyces avidinii, purifiée par affinité, 10 mM de phosphate de potassium, produit lyophilisé de ≧ 13 U/mg de protéine).

PS : Veuillez me dire s'il existe un secret pour le faire se conjuguer uniformément en surface.

PPS : Nous utilisons 5 M d'oligonucléotide modifié animé et 100 nM d'ADN-FAM.


Le carboxylate activé par l'EDC est en fait chargé positivement, bien que je ne puisse pas parler de la densité des carboxylates dans l'hydrogel ou de l'étendue de l'activation avec votre protocole.

Il n'est pas tout à fait clair d'après votre question que vous compreniez le mécanisme d'activation de l'EDC, vous pouvez donc en savoir plus ici (ThermoFisher).

La streptavidine a beaucoup d'amines primaires (lysine et N-terminal) pour réagir avec l'hydrogel activé par EDC ou EDC/NHS, elle devrait donc se conjuguer facilement. Comme il contient également des groupes carboxylate, veillez à activer d'abord la résine, puis à conjuguer la streptavidine pour éviter des réactions secondaires inutiles.


Revisiter 30 ans de biofonctionnalisation et de chimie de surface de nanoparticules inorganiques pour la nanomédecine


João Condé 1 * † , Jorge T. Dias 2† , Valeria Grazú 2 * , Maria Moros 2 , Pedro V. Baptista 3 et Jésus M. de la Fuente 2,4,5
  • 1 Harvard-MIT Division for Health Sciences and Technology, Institute for Medical Engineering and Science, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, États-Unis
  • 2 Groupe de nanothérapie et de nanodiagnostic, Instituto de Nanociencia de Aragon, Universidad de Zaragoza, Saragosse, Espagne
  • 3 CIGMH, Departamento de Ciências da Vida, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade Nova de Lisboa, Caparica, Portugal
  • 4 Fundacion ARAID, Saragosse, Espagne
  • 5 Key Laboratory for Thin Film and Microfabrication Technology of the Ministry of Education, Department of Bio-Nano Science and Engineering, Institute of Nano Biomedicine and Engineering, Research Institute of Translation Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, Chine

Au cours des 30 dernières années, nous avons contribué à une avancée massive des nanomatériaux dans la science des matériaux. Les nanomatériaux et les structures, en plus de leur petite taille, ont des propriétés qui diffèrent de celles des matériaux en vrac plus gros, ce qui les rend idéaux pour une multitude de nouvelles applications. La diffusion de la nanotechnologie au cours des dernières années est due à l'amélioration des méthodes de synthèse et de caractérisation à l'échelle nanométrique, un domaine riche en nouveaux phénomènes physiques et en opportunités synthétiques. En fait, le développement de nanoparticules fonctionnelles a progressé de façon exponentielle au cours des deux dernières décennies. Ce travail vise à passer en revue 30 ans de différentes stratégies de modification de surface et de fonctionnalisation de nanoparticules de métal noble (or), de nanocristaux magnétiques et de nanoparticules semi-conductrices, telles que les points quantiques. L'objectif de cette revue est non seulement de fournir des informations approfondies sur les différentes méthodes de biofonctionnalisation et de caractérisation, mais également de donner un aperçu des possibilités et des limites des nanoparticules disponibles.


1. Introduction

Les nanomatériaux à base de carbone sont les nanomatériaux les plus couramment utilisés dans les études biologiques en raison de leurs caractéristiques de surface polyvalentes, de leurs mérites électriques et optiques. 9,10 Combinée à des variations structurelles, la méthode de production affecte de manière significative les propriétés optiques des nanomatériaux. Pour les nanotubes de carbone, des caractéristiques de taille similaires peuvent présenter des propriétés de type métal, de type semi-conducteur ou des propriétés chirales en fonction de leurs indices d'axe tubulaire et de leurs formes de pliage. Dans le cas du graphène, les propriétés électriques et optiques du matériau peuvent changer considérablement en fonction de la méthode de production qui englobe l'exfoliation en phase liquide, la méthode Hummers et la méthode de dépôt chimique en phase vapeur. Chacune de ces méthodes introduit une variété de défauts dans la structure bidimensionnelle du matériau ainsi que de nouvelles propriétés de surface qui sont utiles pour la biomodification de surface. L'incorporation de nanomatériaux de carbone, tels que les nanotubes de carbone à paroi unique, 11,12 nanotubes de carbone multiparois, 13 nanotubes chiraux, graphène, oxyde de graphène, 14 oxyde de graphène réduit, 15 points quantiques de carbone ou de graphène 16,17 dans les plates-formes de biodétection en tant que transducteurs de signaux est un domaine en pleine croissance. Les biocapteurs fabriqués avec des nanomatériaux à base de carbone pourraient être classés en biocapteurs électrochimiques, biocapteurs optiques et biocapteurs piézoélectriques. Les types de biocapteurs à base de nanomatériaux de carbone, les propriétés structurelles et physiques des nanomatériaux de détection, les mécanismes de détection clés et les progrès récents dans le domaine peuvent être trouvés dans l'étude rapportée par Tran et Mulchandani 18 et Pasinszki et al. 19

Les métaux nobles tels que l'or et l'argent offrent des propriétés optiques uniques et robustes pour le domaine de la biodétection. 3,20 Ils sont largement utilisés dans une pléthore de plates-formes de biodétection en tant qu'éléments de signalisation ou d'amélioration du signal. Les propriétés optiques uniques des métaux nobles découlent de leur capacité à maintenir une oscillation collective liée à la surface des électrons, appelée plasmon de surface, sur leurs interfaces diélectrique-métal dans le spectre visible au proche infrarouge. Sous certains régimes de taille, le plasmon lié à la surface peut être confiné localement et peut être excité par résonance à des longueurs d'onde particulières du rayonnement électromagnétique entrant. La résonance plasmonique de surface localisée (LSPR) est très sensible aux changements d'indice de réfraction dans le milieu diélectrique, et les changements de longueur d'onde de résonance sont très confinés au voisinage de la surface des nanoparticules. La réponse LSPR peut être facilement ajustée en utilisant diverses géométries de substrats de nanoparticules 21,22 ou directement dans la solution 23 en fonction de l'application d'intérêt. La fusion des propriétés optiques uniques des nanomatériaux plasmoniques avec la nature spécifique à la cible des sondes d'affinité a constitué la base de la nano-biodétection plasmonique. 24 Mécanismes de fonctionnement généraux des nanoparticules plasmoniques, y compris la résonance plasmonique de surface (SPR), la résonance plasmonique de surface localisée (LSPR), la diffusion Raman améliorée en surface (SERS) et les applications récentes des nanoparticules plasmoniques dans la biodétection, le diagnostic du cancer, l'administration de médicaments, la photodynamique et la thérapie photothermique ont été examinés récemment par Lim et Gao 25 ​​et Daraee et al. 26

Les nanoparticules luminescentes, par exemple, les nanoparticules à conversion ascendante sont des cristaux céramiques nanométriques dopés aux lanthanides ou aux actinides qui ont été utilisés dans les applications de biodétection depuis la dernière décennie. 27 Les nanoparticules à conversion ascendante absorbent et convertissent au moins deux photons incidents de faible énergie en une seule émission de photons d'énergie plus élevée. Habituellement, l'énergie d'absorption des photons est réalisée en utilisant une concentration plus élevée d'ions dopants dans la région infrarouge afin d'éviter une éventuelle auto-fluorescence provenant d'entités biologiques dans la région ultraviolet-visible (UV-Vis). L'émission fluorescente de photons d'énergie plus élevée se produit à des longueurs d'onde spécifiques du spectre visible suite à l'excitation avec une source de lumière infrarouge. Les valeurs Full-Width Half-Maximum (FWHM) de l'émission fluorescente sont significativement plus étroites que celles générées par les points quantiques. 28 Les points quantiques semi-conducteurs, d'autre part, ne mesurent que quelques nanomètres et peuvent être facilement conçus pour produire une variété de signaux d'émission fluorescents différents dans le spectre visible. La taille, les propriétés de surface et les comportements optiques des points quantiques ont permis leur utilisation dans plusieurs domaines dont l'énergie 29 , la biodétection 30 et la bio-imagerie. 31 Les nanoparticules fluorescentes inorganiques ont été immensément utilisées dans différents mécanismes de détection, notamment la fluorescence directe, le transfert d'énergie par résonance de fluorescence, le transfert d'énergie par résonance de bioluminescence, le transfert d'énergie par chimiluminescence, le transfert d'électrons induit par des photons et l'électrochimiluminescence. Les structures générales des nanomatériaux inorganiques fluorescents, les principes fondamentaux des stratégies de détection moléculaire et une ligne directrice utile d'optimisation de la détection peuvent être trouvés dans le récent article de revue de Ng et al. 32

Les principales méthodes utilisées pour fonctionnaliser ces nanomatériaux avec des anticorps et des aptamères ont été classées en interaction thiol-métal noble, interaction streptavidine-biotine, interaction π-π et chimie NHS-EDC carbodiimide. Parallèlement, la validation de la bio-fonctionnalisation de surface est effectuée par des techniques telles que la spectrophotométrie UV-Vis, le dichroïsme circulaire (CD), la diffusion dynamique de la lumière (DLS) et l'électrophorèse sur gel (GE). Dans ce rapport, nous avons passé en revue les principales méthodes utilisées pour la biomodification de surface des nanomatériaux avec des anticorps et des aptamères ainsi que les techniques de caractérisation les plus courantes qui ont été mises en œuvre pour la validation de la biomodification des nanoparticules. Les structures et les propriétés des sondes d'affinité, y compris les anticorps et les aptamères, ont été brièvement présentées, et les principes fondamentaux des techniques de caractérisation ont été présentés pour fournir au public une ligne directrice complète pour une expérience réussie de modification et de validation de surface.


Introduction

Les peroxysomes sont importants pour l'oxydation des acides gras à très longue chaîne, des prostanoïdes, des acides biliaires intermédiaires et de l'acide pristanique, pour l'oxydation de l'acide phytanique et des acides gras 2-hydroxy et pour la synthèse des précurseurs des éthers lipides chez les mammifères. Ces processus nécessitent un flux continu de substrats, de métabolites et de cofacteurs à travers la membrane peroxysomale, dont les propriétés font encore l'objet de débats. In vitro les données indiquent que la membrane fuit, conséquence des activités des pores/canaux (Van Veldhoven et al., 1987 Antonenkov et al., 2004 Antonenkov et Hiltunen, 2006). D'autre part, cette membrane est prétendue imperméable aux (gros) solutés hydrophiles tels que les nucléotides, au moins in vivo (van Roermund et al., 1995 Henke et al., 1998). Basé sur la perméabilité altérée des peroxysomes hépatiques d'un Pxmp2 –/– knock out mouse (Rokka et al., 2009), PMP22 permet l'entrée de petits solutés neutres (𼌀 Da) avec une limite d'exclusion d'environ 600 Da. Cela implique la présence de systèmes navettes spécifiques ou non spécifiques pour le transport de molécules plus grosses. À ce jour, seules quelques protéines membranaires peroxysomales (PMP) impliquées dans le transport (de soluté) ont été identifiées chez les mammifères. Au premier plan se trouvent trois PMP appartenant à la famille des demi-transporteurs ABC (ATP-binding cassette) (Wanders et al., 2007). ABCD1, l'un de ces transporteurs ABC, anciennement appelé ALDP, provoque une adrénoleucodystrophie liée à l'X chez l'homme (Berger et Gartner, 2006) et joue un rôle dans la captation peroxysomale des acides gras à très longue chaîne et/ou de leurs esters CoA (van Roermund et al., 2008). ABCD3 a récemment été impliqué dans les intermédiaires des acides biliaires et la dégradation de l'acide pristanique (Ferdinandusse et al., 2015).

Un autre transporteur peroxysomal mammifère, PMP34, est un membre de la famille des porteurs de soluté mitochondrial (Wylin et al., 1998). Ce groupe de protéines est caractérisé par trois modules répétés en tandem d'environ 100 acides aminés, constitués de deux hélices transmembranaires hydrophobes α reliées par une grande boucle hydrophile. Les orthologues de PMP34, classés comme membre 17 de la famille des porteurs de solutés 25 (SLC25A17), se trouvent non seulement chez les mammifères, mais aussi chez les amphibiens, les poissons, les insectes, les nématodes, les levures et les plantes. Dans C. boidinii et S. cerevisiae, les orthologues (putatifs) PMP47 (Sakai et al., 1996) et ANT1 (van Roermund et al., 2001) respectivement, facilitent la β-oxydation des acides gras à chaîne moyenne (MCFA). Dans Yarrowia lipolytica, l'utilisation des alcanes à chaîne courte (convertis en acides gras courts) (Thevenieau et al., 2007) est dépendante de ce transporteur. Chez les plantes, les orthologues sont impliqués dans l'oxydation glyoxysomale pendant la germination (Fukao et al., 2001 Arai et al., 2008 Linka et al., 2008) et la génération d'auxines (Linka et al., 2008). En réalité, Arabidopsis les peroxysomes contiennent apparemment au moins trois transporteurs de solutés : PMP38, considéré comme l'orthologue de PMP34 (Fukao et al., 2001), et PNC1 et PNC2 (Linka et al., 2008). Seuls ces derniers sont des contre-échangeurs fonctionnels ATP/ADP + AMP.

Les rapports sur d'autres transporteurs de solutés dans les peroxysomes de mammifères sont un sujet de débat. L'association d'Efinal, un échangeur ATP-Mg/phosphate fixant le calcium (SLC25A24 SCaMC-1), avec les peroxysomes décrits dans les entérocytes iléaux de lapin (Weber et al., 1997), est discutable, étant donné les rapports ultérieurs révélant seulement une localisation mitochondriale pour SCL25A24, soit par immunocoloration de la protéine endogène dans COS-7, HEK-293T, souris 3T3-L1 ou fibroblastes humains, soit lors de l'expression de la protéine humaine dans des cellules COS-7 (del Arco et Satrùstegui, 2004). La localisation peroxysomale revendiquée d'un transporteur de carnitine (SLC22A3 OCTN3) (Lamhonwah et al., 2005) n'a pas pu être confirmée dans notre laboratoire, et plus important encore, aucune anomalie peroxysomale n'a pu être démontrée dans Ocnt3 Souris –/– (Ansari S. et Van Veldhoven P.P., données non publiées). La présence putative des transporteurs monocarboxylates SLC16A1 (MCT1) (McClelland et al., 2003) et SLC16A7 (MCT2) (McClelland et al., 2003 Valenca et al., 2015) est uniquement basée sur l'immunotransfert de peroxysomes purifiés de foie de rat (McClelland et al. al., 2003) ou l'immunocolocalisation dans les cellules cancéreuses de la prostate (Valenca et al., 2015). Apparemment, MCT2 n'est que partiellement associé aux peroxysomes dans les cellules prostatiques malignes, mais pas dans les cellules prostatiques normales (Valenca et al., 2015). Enfin, à l'exception de PMP34, aucun autre transporteur de soluté n'a été détecté dans les études protéomiques sur les peroxysomes ou les membranes peroxysomales (Kikuchi et al., 2004 Wiese et al., 2007 Islinger et al., 2010 Gronemeyer et al., 2013).

Bien que la PMP34 humaine, similaire à l'ANT1, puisse partiellement sauver le défaut d'oxydation du MCFA dans fourmi1Δ cellules de levure et est capable de transporter des nucléotides d'adénine dans un in vitro (Palmieri et al., 2001 Visser et al., 2002), son rôle physiologique dans les peroxysomes mammifères reste incertain. Contrairement à la levure, les MCFA subissent une oxydation β dans les mitochondries et, comme détaillé ci-dessous, les réactions intra-peroxysomales dépendantes de l'ATP sont à peine documentées chez les mammifères. L'acyl-CoA synthétase à très longue chaîne (ACSVL1 SLC27A2), contenant un signal de type PTS1 (LKL) chez la souris et l'homme, activerait l'acide pristanique intra-peroxysomal produit par α-oxydation de l'acide phytanique (Steinberg et al., 1999). La phytanoyl-CoA hydroxylase, impliquée dans l'oxydation α, est stimulée par l'ATP (ou GTP) (Croes et al., 2000), mais cela se limite probablement à in vitro conditions. De plus, deux étapes consommatrices d'ATP de la biosynthèse du cholestérol ont été signalées dans les peroxysomes (Olivier et Krisans, 2000), mais la localisation subcellulaire des enzymes responsables est discutable (Ghys et al., 2002 Hogenboom et al., 2004a, b) . L'ATP intraperoxysomal pourrait être nécessaire pour le repliement correct d'un sous-ensemble de protéines de la matrice peroxysomale, comme cela a été suggéré par le fait que la dihydroxyacétone synthase peroxysomale (DHAS) est mal repliée en l'absence de PMP47 dans C. boiidini (Sakai et al., 1996). Il est également possible que l'ATP soit nécessaire pour éliminer les protéines endommagées puisque les peroxysomes des mammifères contiennent une protéase ressemblant à la protéase mitochondriale Lon (Kikuchi et al., 2004). La protéase humaine présente en effet une activité peptidase dépendante de l'ATP (De Walque S. et Van Veldhoven P.P., données non publiées). Les peroxysomes contiennent encore d'autres protéines dépendantes de l'ATP comme les transporteurs ABC mentionnés ci-dessus (Wanders et al., 2007) mais leurs sites de liaison à l'ATP, cependant, font face au cytosol. Il en va de même pour certaines peroxines dépendantes de l'ATP (Platta et al., 2008). Des données récentes sur les transporteurs ABC peroxysomaux de levures et de plantes indiquent cependant une hydrolyse des esters d'acyl-CoA pendant leur transport, mettant en œuvre leur réactivation dans la lumière peroxysomale (van Roermund et al., 2012 De Marcos Lousa et al., 2013). La façon dont ce mécanisme peut être appliqué aux carboxylates qui ne sont activés que dans le RE (par exemple, les acides dicarboxyliques) chez les mammifères n'a pas été abordée dans ces articles.

Pour mieux comprendre le rôle de PMP34 chez les mammifères, nous avons analysé des souris chez lesquelles Slc25a17, le gène codant pour PMP34, a été inactivé par mutagenèse insertionnelle, en mettant l'accent sur les processus dépendants de l'ATP 1 . Au cours de ce travail, Bernhardt et al. (2012) ont rapporté que le Arabidopsis PMP38 a agi comme un antiporteur NAD + /AMP tandis qu'Agimi et al. (2012) ont montré que le PMP34 humain (SLC25A17) est un transporteur pour CoA, FAD, FMN et AMP, dans une moindre mesure pour ADP et NAD + , mais presque pas actif sur ATP, et fonctionnant comme un contre-échangeur (probablement CoA, FAD , NAD + AMP vers l'intérieur vers l'extérieur). Le CoA intraperoxysomal serait requis pour toute étape d'activation au sein de ces organites, comme déjà discuté ci-dessus. De plus, c'est un cofacteur pour le clivage thiolytique dans le cycle d'oxydation β. Contrairement à l'ATP, le CoA est cependant généré à l'intérieur de la matrice peroxysomale via l'action d'acyl-CoA thioestérases, de carnitine acyltransférases et d'enzymes de conjugaison (Hunt et Alexson, 2008 Van Veldhoven, 2010). Au vu de ces nouvelles informations, des paramètres peroxysomaux supplémentaires ont été analysés chez les souris knock-out. Des anomalies phénotypiques chez des souris déficientes en PMP34 après une alimentation en phytol indiquent un goulot d'étranglement dans la dégradation des acides gras à chaîne ramifiée.


Acides aminés, peptides et protéines

Keith D. Green , Sylvie Garneau-Tsodikova , dans Comprehensive Natural Products II , 2010

5.15.10.1 Biotinylation

La biotinylation des protéines est catalysée par la biotine protéine ligase (BPL). Dans le site actif de l'enzyme, la biotine est activée aux dépens de l'ATP pour former de l'AMP-biotine la biotine activée peut alors réagir avec un nucléophile sur la protéine ciblée. BPL transfère la biotine à une lysine spéciale sur la protéine porteuse de la biotine carboxyle (BCCP), une sous-unité de l'AcCoA carboxylase ( Schéma 21 ). 135 La biotinylation de BCCP est très importante dans la biosynthèse des acides gras, en commençant la croissance de l'acide gras avec AcCoA carboxylase pour générer du malonyl-CoA. Récemment, les structures cristallines de BPL et BCCP mutées ont été résolues avec la biotine et l'ATP pour avoir une meilleure idée du fonctionnement du transfert. 135

Schéma 21 . Biotine captive dans l'activité carboxylase. La biotine est attachée aux protéines carboxylases et sert de détenteur de CO2 unités de synthèse des acides gras.


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    2011 2011 MRS Fall Meeting, 28 novembre - 2 décembre 2011 Hynes Convention Center, Boston, MA (États-Unis)
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    2011 2011 MRS Fall Meeting, 28 novembre - 2 décembre 2011 Hynes Convention Center, Boston, MA, États-Unis
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    2011 48e réunion annuelle du Comité de coordination de la recherche sur le botulisme interinstitutions (IBRCC), Santa Fe, Nouveau-Mexique, États-Unis, 5-7 octobre 2011
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  • Yuan Y, Riehle F, Nitschke R, Krueger M
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    2011 E-MRS Spring Meeting, 9-13 mai 2011, Palais des Congrès, Nice (France),
  • Krueger M
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    2011 EMRS Spring Meeting, 09-13 mai 2011, Palais des Congrès Nice (France)
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    2011 DPG Frühjahrstagung à Dresde, 13.03.-18.03.2011
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    2011 Quantum Efficiency Seminar, Physikalisches Institut, Université de Fribourg
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  • Zhou Y, Urban G, Krueger M
    Cellules solaires à hétérojonction en vrac basées sur des matériaux hybrides nanocristaux-polymères
    2008 17. FMF Kolloquium, Hornberg
  • Krueger M, Yuan Y, Riehle F S, Gu H, Urban G
    Paramètres critiques pour la synthèse de nanocristaux semi-conducteurs (points quantiques)
    2008 IC4N 2008 : 1st International Conference from Nanoparticles and Nanomaterials to Nanodevices and Nanosystems, Halkidiki, Grèce
  • Kieninger J
    Contrôle global et local de l'oxygène dans les systèmes in vitro
    2008 Cours EUROXY, Toscane, Italie
  • Krueger M
    Nanopartikel Quo Vadis
    2008 17. FMF Kolloquium, Hornberg
  • Krueger M
    Les nanosciences au Centre de recherche sur les matériaux de Fribourg
    2008 Vortrag am Institut für Physik, Université de Bâle
  • Hussein L, Urban G, Krueger M
    Nouvelles nanoparticules ultra-petites sur du papier Bucky à nanotubes comme électrocatalyseur pour les piles à combustible implantables à glucose
    2008 17. FMF Kolloquium, Hornberg
  • Krueger M
    Anwendungen von halbleitenden Nanokristallen in der Biologie, den Materialwissenschaften und der Medizin
    2007 16. FMF Kolloquium, Rouille
  • Riehle F, Urban G A, Cardot P J, Krueger M
    Tri cellulaire avec des nanocristaux
    2007 16. FMF Kolloquium, Rouille
  • Kieninger J
    Outils pour la mesure de l'oxygène
    2007 Cours EUROXY, Maastricht, Pays-Bas
  • Krueger M
    Bausteine ​​für Quantenaggregate
    2006 Quantenaggregate Seminar, Institut für Physik, Universität Freiburg

Détermination de l'étendue de la biotinylation

Les conditions de réaction pour la biotinylation sont choisies de sorte que la molécule cible (par exemple, un anticorps) soit marquée avec suffisamment de molécules de biotine pour purifier ou détecter la molécule, mais pas au point que la biotine interfère avec la fonction de la molécule.

Dosage HABA

Le dosage HABA (acide 2-(4-hydroxyazobenzène) benzoïque) peut être utilisé pour déterminer l'étendue de la biotinylation. Le colorant HABA est lié à l'avidine ou à la streptavidine et donne une absorbance caractéristique. Lorsque des protéines biotinylées ou d'autres molécules sont introduites, la biotine déplace le colorant, entraînant un changement d'absorbance à 500   nm. Ce changement est directement proportionnel au niveau de biotine dans l'échantillon. L'inconvénient du test HABA est qu'il utilise de grandes quantités d'échantillon.

Gel-shift à la streptavidine

L'étendue de la biotinylation peut également être mesurée par le gel-shift de la streptavidine, puisque la streptavidine reste liée à la biotine pendant l'électrophorèse sur gel d'agarose ou l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide. La proportion de cible biotinylée peut être mesurée via le changement d'intensité de bande de la cible avec ou sans excès de streptavidine, observé rapidement et quantitativement pour les protéines biotinylées par coloration au bleu brillant de Coomassie. [20]


Conclusion

Les biocapteurs électrochimiques pour la détection précoce des infections virales ont attiré l'attention en raison de leur sélectivité et de leur sensibilité ainsi que de leur large plage dynamique, de leur fabrication simple, de leur analyse rapide et de leurs petits volumes d'échantillons. Cette revue décrit les développements récents dans la fabrication et l'application de biocapteurs électrochimiques pour la détection de virus. Ces exemples prouvent que les biocapteurs électrochimiques peuvent offrir des avantages par rapport aux méthodes conventionnelles telles que le dosage immuno-enzymatique, la réaction en chaîne par polymérase ou le transfert western en raison de leurs caractéristiques telles que la simplicité, la portabilité, la miniaturisation, la disponibilité, la réponse rapide, l'analyse en temps réel. De plus, les marqueurs radioactifs, les colorants toxiques et les instruments coûteux ne sont pas nécessaires avec les biocapteurs électrochimiques. De nos jours, divers nanomatériaux tels que les nanoparticules d'or, les nanomatériaux de carbone, les nanoparticules magnétiques ou les billes magnétiques, les points quantiques et les nanostructures hybrides ont été utilisés pour la fabrication de biocapteurs afin d'améliorer leur sensibilité et leur stabilité. De plus, les puces à ADN intégrées aux systèmes microfluidiques permettent généralement une fabrication à faible coût et une détection virale simultanée. Bien que les biocapteurs électrochimiques présentent des caractéristiques prometteuses, certains des biocapteurs signalés doivent être validés dans des échantillons réels.


Revêtements antifouling

Dans cette section, nous présentons les principales approches du développement de revêtements antifouling.

Monocouches auto-assemblées (SAM)

Les monocouches auto-assemblées sont des monocouches hautement ordonnées de molécules amphiphiles compactes (Fig. 1). Une structure typique des molécules est R1–(CH2) m–R2, où R1 est un fragment hydrophile en position , (CH2) m est une chaîne alcane non polaire, et R2 est un groupe sur la position qui est chimiquement réactif avec le substrat. Typiquement, les chaînes alcanes ayant 11 groupes méthylène ou plus (m) sont utilisés pour favoriser l'assemblage de molécules amphiphiles très compactes sur une surface. La chimisorption des molécules via R2 et l'ordre (via les interactions hydrophobes et les forces de dispersion entre leurs chaînes alcanes) entraînent la formation d'un SAM coiffé d'une couche compacte du R1 fractions hydrophiles. Les groupes thiol (–SH) ont été principalement utilisés comme R2 pour la préparation de SAM sur silane d'or ou d'argent (par exemple, -SiCl3) est utilisé comme R2 sur le verre et le silicone et le silane ou le phosphate est utilisé comme R2 sur une variété de surfaces d'oxyde métallique. Une couche intermédiaire hydrophobe dense de chaînes alcanes organisées et une couche de fragments hydrophiles au-dessus du SAM diminuent les taux d'encrassement en empêchant le contact direct des protéines avec la surface du substrat et en diminuant l'énergie interfaciale libre entre la surface et les milieux aqueux, respectivement. Des fragments oligo(éthylène glycol) (OEG) compacts contenant seulement quelques unités d'éthylène glycol sur des SAM à terminaison OEG ont pu empêcher l'adsorption des solutions à une seule protéine [80, 81].

Self-assembled monolayers (SAMs) of alkanethiols terminated with oligo(ethylene glycol) (OEG) or mixed OEG–OH and OEG–COOH

Chapman et al. pioneered research on protein adsorption onto ω-functional SAMs. A survey of the resistance of more than fifty SAMs terminating in different groups [48] to fouling from Fbg and Lys solutions led to a description of physical-chemical properties that should be fulfilled to achieve protein resistance of the coating. These properties included the surface being hydrophilic, electro-neutral, having hydrogen-bond acceptors, and lacking hydrogen-bond donors [48, 82].

Oligo(ethylene glycol)-terminated SAMs

Oligo(ethylene glycol)-terminated SAMs (OEG m SAM, where m denotes the number of ethylene glycol units) have been the most widely used antifouling coatings. OEG SAMs have been used in several important theoretical and experimental studies as a model surface to investigate the mechanism of surface protein-resistance [83–91]. High internal and terminal hydrophilicity and a high lateral packing density have been recognized as factors that determine the protein-fouling resistance of OEG m SAMs. [85].

Although OEG m SAMs can effectively reduce or prevent adsorption from single-protein solutions (blood-plasma related) in PBS, there have been several reports of a lack of resistance to fouling from undiluted blood plasma and other complex media [8, 9, 45, 92]. The fouling from blood plasma decreased with increasing number of ethylene glycol units, m (Tableau 1). Mixtures of R2–(CH2)11–OEG m and R2–(CH2)11–OEG m–F have been used for the preparation of SAMs to which bioreceptors can be attached via the functional groups F (where F includes COOH, NH3, and biotin) [93–96].

Zwitterionic SAMs

Zwitterionic surfaces contain positively and negatively charged moieties in balanced amounts, thus creating surfaces with a net neutral charge. Whereas OEG m surfaces are hydrated via hydrogen bonding, zwitterionic surfaces can bind water molecules even more strongly via hydrogen bonds and ionic solvation [32, 46, 97]. Holmlin et al. prepared mixed SAMs from a 1:1 combination of alkanethiols terminating in positively charged tri(methyl)ammonium (TMA) and alkanethiols terminating in a negatively charged sulfonate group (SO) [46]. The mixed TMA–SO SAMs reduced the adsorption from Fbg and Lys solutions to less than 1 % of a protein monolayer. The SAMs prepared from only one of these charged components had higher fouling levels, corresponding to a near-saturated protein monolayer [46]. These results emphasized the important effect of electro-neutrality in preventing protein adsorption.

SAMs composed of alkanethiols terminating in highly wettable sulfobetaine (SB) or phosphorycholine (PC) zwitterion groups have also been revealed to be capable of reducing adsorption from single-protein solutions [44, 46, 97, 98]. The results suggest that SB SAMs are substantially more effective in resisting Fbg and Lys adsorption than PC SAMs [44, 46, 98].

Other SAMs

Surfaces resistant to adsorption from single-protein solutions have been prepared from SAMs terminating in a variety of hydrophilic groups. These groups include tri(propylene sulfoxide) (TPS) [99], Mannitol [100], gulitolor mannonamide [101], hyperbranched or dendritic polyglycerol [102], and oligopeptides [103]. None of these SAMs were tested for fouling from blood plasma or serum.

Sommaire

Table 1 summarizes the published data on protein adsorption from single-protein solutions of IgG, HSA, Fbg, and Lys, and fouling from undiluted blood plasma on SAMs (including the methods of characterization). SAMs capped with densely packed helical OEG m seem to provide a more effective resistance to both protein adsorption and fouling from blood plasma than SAMs capped with other hydrophilic moieties. Unfortunately, none of the reported SAMs had low-fouling properties when exposed to undiluted blood plasma or serum.

The great advantage of SAMs lies in the ease of fabrication and the availability of alkanethiols. For example, HS(CH2)11EG m avec m = 2–6 can be relatively easily synthesized or purchased from a variety of sources. In summary, SAMs are suitable for use in biosensor and microarray applications involving buffer solutions or diluted complex media (<

15 %) [15, 104–106]. The lowest fouling from blood plasma on SAMs was obtained for (CH2)11EG6 SAMs (Table 1). The thickness of these SAMs is only 2.5 nm [83]. It is worth mentioning that such a low thickness of SAMs is attractive for biosensors with a highly localized evanescent field, e.g. sensors based on localized surface plasmon resonance (LSPR) [107, 108].

PEG-based coatings

For many years, surface coatings based on nontoxic, nonimmunogenic, and uncharged ethylene glycol oligomers (OEG) and polymers (PEG) have been used to reduce protein fouling on a variety of biomedical surfaces.

Also, linear PEG chains have been grafted to surfaces to create antifouling coatings. The high solubility and strong interaction of PEG chains with water does not enable reliable grafting of PEG homopolymers themselves by physical adsorption. In a few reports, PEG containing structural motifs capable of electrostatic or hydrophobic physisorption have been immobilized on different substrates however, only poor stability and poor resistance to fouling were observed [109–112].

The electrostatic adsorption of comb polymers, composed of a polyelectrolyte backbone of poly(L-lysine) (PLL) and pendant PEG chains (PLL–g–PEG) on negatively charged surfaces, has not been revealed to be stable at higher ionic strength [12, 113]. Improved stability was achieved when physisorption was combined with covalent binding of amino groups on the PLL backbone to aldehyde groups present on a previously deposited plasma polymer [12]. A triblock copolymer of PEG with poly(propylene oxide) (PPO) in the form PEG–PPO–PEG [114] or with poly(butadiene) (PB) in the form PEG–PB–PEG [115] has been adsorbed via hydrophobic blocks of PPO or PB onto different hydrophobic surfaces and subsequently chemically grafted by γ-irradiation. Zoulalian et al. grafted a terpolymer of PEG–poly(alkyl phosphonate)–PEG (PEG–PAP–PEG) to TiO2 and Nb2O5 surfaces via the PAP block, which obtained a reduction in fouling from blood plasma as observed by ellipsometry, XPS, and OWLS [116, 117]. Even if the PAP block provided a multivalent linkage to TiO2 and Nb2O5 surfaces, a significant loss of the polymer was observed after only 3 h in different aqueous solutions [116], limiting its use for real applications. Only fouling from single-protein solutions has been tested on the other previously mentioned physisorbed polymers. Stable antifouling coatings composed of linear PEG chains have been prepared by the chemical binding of PEG with a functional terminal group to reactive groups present on a substrate surface (Fig. 2) [118]. Reactive ω-trichloro silane-PEG (PEG-OSiCl3) [119] and ω-mercapto-PEG (PEG-SH) [40, 120–123] have been grafted via covalent bonds to silicon and gold surfaces, respectively. Similarly, PEG conjugated with a catecholic chelating group, for example dopamine (PEG–DOPA) [124–126] or anachelin (PEG–ANACH) [127], has been tethered onto different metal oxides by complexation via coordinate bonds [85, 88, 128]. Activated carboxyl groups on a self-assembling monolayer of mixed alkanethiols terminating in either OEG or carboxylic groups have been used for the covalent attachment of ω-amino-PEG (M w = 3400 g mol −1 ) [9]. The resulting PEG–SAMs coatings decreased blood-plasma fouling.

Grafting SH–PEG chains from solution to gold surface. Polymer chains are chemisorbed via the SH-terminal group, where R can be the OH-terminal of PEG or a functional group for the attachment of bioreceptors

Several works have reported a decrease in protein adsorption with both increasing grafting density (?? = number of polymer chains per nm 2 ) and increasing length of the PEG chains grafted to a surface [40, 121, 123, 129–132]. Layers with increasing grafting density pass from a single grafted chain (mushroom) regime to a brush regime with deformed polymer coils. A polymer brush is formed when the average distance between polymer-chain anchoring points S (S −2 = ??) approaches the size of the polymer in solution, which is characterized by the double Flory radius R F of the polymer random coil (S = 2R F), (Fig. 2a) [133]. At higher grafting densities the polymer coils become deformed (Fig. 2b) [36, 133, 134].

High grafting densities have been achieved when PEG-SH, PEG–DOPA, and PEG–ANACH were grafted from a solvent of poor thermodynamic quality nearing a “cloud point” condition. Under such conditions, the PEG coil dimensions are reduced and thus minimize the excluded volume interactions between adsorbing polymer chains [121, 122, 135]. When the coatings are used in aqueous solutions, a high osmotic pressure can cleave the coordinate bonds between PEG–DOPA or PEG–ANACH and the substrate. More than three dopamine groups per PEG chain were required to ensure the coating stability [125].

Brash et al. performed extensive studies on the PEGylation of gold using R–PEG-SH of different molecular weights and terminal groups [40, 120–122, 136]. The surfaces were exposed to blood plasma spiked with radiolabelled fibrinogen, where fibrinogen adsorption from plasma decreased with increasing grafting density [121, 122]. The lowest adsorption of fibrinogen was observed at the highest grafting densities, reached when PEG-SH was immobilized from a solvent of poor thermodynamic quality near “cloud point” conditions [40, 121].

Pop-Georgievski et al. coated gold and several other substrates with ultrathin layers of poly(dopamine) and grafted ω-amino-PEG from a melt to these layers, obtaining a grafting density much higher than that obtained by grafting the polymer from solutions (even on non-reactive substrates) [118]. The poly(dopamine) interlayer adhered strongly to a variety of inert substrates and contained multiple functional groups available for grafting [118, 126]. The melt grafting of PEG ensured no excluded volume interactions, maximum grafting density, and substantially higher thickness. The achieved level of blood-plasma fouling (20 pg mm −2 ) is the lowest reported for PEG grafted to any surface to date [118]. However, a decrease in the PEG thickness, with loss of resistance to plasma fouling, was observed after only one day’s storage in PBS, most probably brought about by the washing out of non-covalently bound entangled polymer chains [118].

PEG-like surfaces have also been prepared by plasma polymerization and/or deposition techniques [137–139]. These coatings have been revealed to reduce the adsorption of BSA, IgG, and Fbg [138, 139].

PEG coatings that have resistance to fouling from blood plasma or serum are summarized in Table 2. In summary, only the PEG grafted from melt to a poly(dopamine) layer had ultra-low-fouling properties however, this surface lost its resistance within one day of storage in PBS.

Polymer brushes

Polymer brushes are ultra-thin polymeric films consisting of closely-packed polymer chains tethered to a surface by one end (Figs. 2 and 3) [6, 133, 134]. If the grafting density is very high, the polymer chains adopt an unusual conformation, wherein the individual polymer coils overlap [38, 134]. Under these conditions, the polymer molecules are strongly stretched away from the surface and achieve a unique molecular conformation different from the random coil [6, 134].

Polymer brushes grafted from a surface by surface-initiated atom-transfer radical polymerization (SI-ATRP)

Polymer brushes can be prepared by either a “grafting-to” or a “grafting-from” approach. The “grafting-to” approach (Fig. 2) consists of the attachment of polymer chains to a surface via physisorption [32, 113], chemisorption [125, 140], or covalent bonding [40, 120–123]. The final grafted-to brush structure is characterized by the grafting density ??, which is the number of polymer chains per nm 2 [133, 134]. The protein adsorption typically decreases with both increasing grafting density and increases in the length of the attached grafted-to polymer chains [40, 121, 123, 129–131, 141]. Although this method is experimentally straightforward, only limited grafting densities have been achieved [133, 134]. To date, the grafting of polymers from solutions to a variety of substrates has resulted in coatings with blood-plasma fouling higher than 100 pg mm −2 . The “grafting-from” approach (Fig. 3) uses controlled surface polymerizations for the preparation of very dense brushes by growing each chain at virtually the same rate. Methods of preparation include anionic and cationic polymerization [142, 143], nitroxide-mediated polymerization (NMP) [144], ring-opening polymerization [145], reversible addition-fragmentation transfer polymerization (RAFT) [146], single-electron-transfer living radical polymerization (SET-LRP) [147], and atom-transfer radical polymerization (ATRP) [148]. Polymer chains grow at the same rate from initiators or chain-transfer agents (CTAs) attached to a surface after their exposure to a monomer containing polymerization solution [6, 134]. Initiators, CTAs, or pre-formed polymers are attached via a variety of chemical reactions specific to the substrate surface [13, 149–154]. Chemically inert substrates require either specific modification [6, 151, 155] or a coating having an ultrathin layer with reactive groups, for example autopolymerized poly(dopamine) [118, 156] or RF-magnetron-sputtered amino-rich nylon [10].

The surface-initiated ATRP method (SI-ATRP) is the most widely used technique for the preparation of brushes (Fig. 3) [134, 157]. Surfaces coated with a designed pattern of initiator SAM brushes can be prepared by depositing an initiator SAM using microcontact printing (μCP) or dip-pen nanolithography.

Low-fouling, ultra-low-fouling, and non-fouling brushes with very high grafting densities of nearly stretched polymer chains have been prepared by the “grafting-from” SI-ATRP approach (Fig. 3). Polymer chains grow from a substrate surface with covalently bound ATRP initiators after exposure to a polymerization solution containing monomers and a catalyst system dissolved either in water or in a water–polar solvent mixture. If SI-ATRP polymerization is living and well controlled, the length of the “grafted-from” polymer chain increases linearly with the polymerization time. This makes it possible to adjust the brush thickness at a nanometer scale or to prepare brushes with a multiblock architecture [10, 156, 158, 159]. Unlike “grafted-to” brushes, the grafting density and molecular mass of polymer chains in “grafted-from” polymer brushes cannot be quantified.

Brushes of polymers with oligo(ethylene glycol) side chains

Ma et al. revealed that brushes of oligo(ethylene glycol)methacrylate monomers (HOEGMA) prepared by SI-ATRP can be used as low-fouling surfaces [160, 161]. These cylindrical brushes consisted of pHOEGMA chains with a methacrylate backbone and OEG side chains. The dense low-fouling brushes of pHOEGMA have been grown from gold [65, 68, 94, 156, 160, 161], silica and/or silicon [151, 162, 163], TiO2 [164], polymeric nanocapsules [154], and a variety of polymer surfaces [10, 155].

Huck et al. obtained a well-controlled SI-ATRP of pHOEGMA and pMeOEGMA brushes by optimizing the polymerization system. [162]. The application of well-controlled living SI-ATRP made it possible to adjust the brush thickness at a nanometer scale of up to 180 nm by simply changing the polymerization time in this manner they established a minimum thickness that ensured the best protection against blood-plasma fouling [8, 10, 92, 159]. Rodriguez-Emmenegger et al. assessed the fouling from blood plasma and different body fluids on both pHOEGMA and pMeOEGMA brushes prepared under the optimized conditions [92], obtaining an approximately 90 % decrease in plasma fouling with a brush thickness of 30 nm [8, 10, 92, 159, 165].

Kizhakkedathu et al. grafted PEG-based N-substituted acrylamide from polystyrene particles and oligo(ethylene glycol) methyl ether acrylamide (pMeOEGA) from latex particles. The fouling from undiluted blood plasma on pMeOEGA (measured using SDS-PAGE) was as high as 370 pg mm −2 [166, 167].

Poly(zwitterionic) brushes

Poly(zwitterions) are macromolecules containing identical numbers of anionic and cationic species on the same monomer units, which can be completely dissociated and thus will maintain an electro-neutral state [167, 168].

Polymer brushes of methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) have been prepared by SI-ATRP polymerization [169–171]. The adsorption of BSA, Lys, Fbg, IgG, von Willebrand factor, and Hageman factor in PBS and fouling from blood plasma [9] have been evaluated. Even if there was only minor adsorption from solutions of the main plasma proteins on the pMPC brushes, huge fouling (3450 pg mm −2 measured by SPR) was observed when the MPC brushes were exposed to blood plasma [9]. It should be noted that, being one of the most hydrophilic surfaces (water-contact angle of ?? adv = 18° and ?? rec = 7° [9, 171]), the pMPC had fouling levels from blood plasma comparable with that seen on bare gold.

Highly hydrophilic surfaces have been prepared by coating substrates with polymer coatings based on N-(3-sulfopropyl)-N-(methacryloxyethyl)-N,N-dimethylammonium sulfobetaine methacrylate (SBMA) [172–175]. There was no adsorption from solutions of the main plasma proteins on pSBMA brushes prepared by SI-ATRP [9, 176, 177] however, fouling from blood plasma ranged from 75 to 2400 pg mm −2 and was dependent on the thickness of the brush [9, 178]. The lack of functional groups for covalent coupling to bioreceptors and the high coating thickness required to reduce the plasma fouling (60 nm in dry state) substantially limits the use of pSBMA for biosensors.

Zhang et al. were the first to introduce poly(carboxybetaine methacrylate) brushes (pCBMA), revealing their resistance to fouling from Fbg, human choriogonadotropin (hCG), and Lys. They also revealed the covalent attachment of bioreceptors to pCBMA [13]. This work was followed by the synthesis of carboxybetaine acrylamides (pCBAA) with a methylene (pCBAA-1), ethylene (pCBAA-2), propylene (pCBAA-3), and pentylene (pCBAA-5) spacer between the charged groups, and carboxybetaine methacrylate with an ethylene spacer (CBMA-2): these brushes were also tested for Fbg adsorption as a function of ionic strength and pH [179]. A total resistance to Fbg adsorption was achieved for the pCBAA-2. Later, the fouling from undiluted blood plasma on pCBAA-2 was found to be below the detection limit of the SPR sensor used (<3 pg mm −2 ) [8, 34, 92, 152]. Although pCBMA-2 has a resistance to plasma fouling [9] similar to that of pCBAA-2, the latter has a higher hydrolytic stability [178, 180]. A non-fouling di-block brush was prepared by growing pCBAA-2 from living terminal groups of a pMeOEGMA brush [8, 10, 92, 159]. The main disadvantage of both pCBMA and pCBAA brush preparation is a lack of thickness control in their SI-ATRP [8, 10]. Therefore, the brush thickness cannot be tuned by polymerization time, but only by empirical changes to the polymerization system.

Other types of polymerization have been used to gain control over the polymerization process, including nitroxide-mediated polymerization [181], reversible addition-fragmentation transfer [180], and single-electron-transfer living radical polymerization (SET-LRP) [182] however, no reports on the resistance of these new coatings to blood plasma have been presented. Poly(CBMA-2) brushes have also been prepared by the “grafting to” approach. pCBMA-2 chains bearing dopamine at one end (DOPA-pCBMA) were grafted via the DOPA terminus either to an SiO2 film deposited on a gold layer of a SPR sensor or to silicon microcantilevers on a suspended microchannel resonator [140, 152]. Both studies obtained low fouling from undiluted blood plasma (51 pg mm −2 ).

Poly(betaine) brushes do not usually have long-term stability in aqueous solutions. Several studies have reported a reduction in the thickness (approximately 20 %) of pCBAA-2 brushes after only 15 days’ storage in PBS, most probably caused by the detachment of chains [183], which results in a deterioration of their antifouling properties [8, 183]. Similarly, the thickness of pSBMA brushes was reduced from 31 to 21 nm after four days’ storage at 40 °C in water [176].

More recent attempts include the use of poly(ampholyte) brushes composed of alternating positively and negatively charged monomers having an overall neutral charge [178, 184–186]. McCormick et al. revealed a high alternating tendency of the oppositely charged monomers [186], copolymerizing as ion pairs [187, 188]. Bernard et al. revealed that polymer brushes of (2-(methacryloyloxy)ethyl) trimethylammonium chloride (pTMA) and 3-sulfopropyl methacrylate potassium salt (pSA) could be prepared by ATRP [185] using the concept proposed by McCormick. Only minimal fouling from Fbg or Lys [184, 188, 189] was observed on these surfaces, whereas higher levels of fouling (76.5 pg mm −2 ) [184] from 20 % blood plasma were found using a SPR sensor. Even using much thicker brushes, the resistance of poly(TMA-co-SA) was comparable with that of OEG m SAMs and substantially worse than that of pCBAA-2.

Hydroxy-contained brushes

Hydrophilic polymer brushes of non-ionic, hydroxy-functional monomers based on 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) [43, 92, 156, 158, 183, 190], 3-hydroxypropyl methacrylate (HPM) [8, 191], and N-(2-hydroxypropy) methacrylamide (HPMA) [8, 92, 158, 183, 192] have been prepared via SI-ATRP, and their protein resistance has been evaluated by SPR [8, 92, 152, 183, 190, 191]. All of these brushes completely prevented fouling from single-protein solutions.

The fouling from undiluted blood plasma on pHPM was 410 pg mm −2 [8], or 530 pg mm −2 if a mixture of HPM isomers under poorly controlled conditions was used [183]. Zhao et al. prepared pHEMA coatings that had a minimum plasma fouling of approximately 30 pg mm −2 at a thickness of 30 nm [183].

Fouling from undiluted blood plasma below the SPR detection limit has been achieved on 18 nm thick pHPMA brushes grafted from gold SPR chips by SI-ATRP [8]. No fouling was observed, even when the pHPMA surface was repeatedly exposed to blood plasma after three and 24 months of storage in PBS: the fouling observed in the same experiment on non-fouling pCBAA-2 brushes increased to 1250 pg mm −2 after 24 months. The fouling of pHPMA brushes was in the range 0–13 pg mm −2 for plasma from different individual donors, and 0–8 pg mm −2 for pooled plasma from different commercial sources [192]. Fouling rates were below the limit of SPR detection for a variety of biological fluids, including cerebrospinal fluid, urine, saliva, fetal bovine and calf sera, eggs, and milk [92].

In comparison with any other known antifouling surface, the total resistance to undiluted blood plasma and the long-term stability seem to be the most important properties of pHPMA brushes. A disadvantage of pHPMA-brush preparation is the lack of control of its SI-ATRP, which precludes controlling their thickness by polymerization time or using their living terminal groups for immobilization of bioreceptors. The thickness is adjusted by empirically changing the polymerization system. The not fully reversible activation of hydroxyl side groups (see section “Activation and deactivation of functional groups of low-fouling coatings”) also limits the biosensor applications of pHPMA brushes.

Other brushes

Polymer brushes of first and second generation dendritic acrylate monomers (linear oligoglycerol methacrylate and glycerol methacrylate) have been grown from gold, and fouling from single-protein solution and blood plasma has been assessed [193]. A more crowded architecture of the brush (for example that of dendritic brushes) resulted in fouling levels from blood plasma (240 pg mm −2 ) that were lower than those for linear or bottle brushes (510–690 pg mm −2 ), indicating the importance of the architecture of the brush [193].

Different peptoids [194], poly(β-peptoid)s [183], and polyoxazolines [195] have been grafted to surfaces that have obtained minimum adsorption of proteins from single-protein solutions and low fouling from undiluted blood plasma (40 to 97 pg mm −2 ) for short contact times.

Saccharide polymer brushes [196] and brushes of N-substituted acrylamide containing different carbohydrates [197] have also been used to achieve reduced protein fouling from single-protein solutions however, poor results were obtained when the surfaces were exposed to blood plasma.

The published data on the fouling resistance of polymer brushes are summarized in Table 3. It can be seen from the table that the hydroxyl-functional pHPMA and carboxy-functional pCBAA and pCBMA have no detectable fouling from undiluted blood plasma and therefore can be regarded as non-fouling coatings. High blood-plasma fouling is observed on some surfaces that are completely resistant to adsorption from single-protein solutions of HSA, Fbg, and IgG, which are present in plasma at the highest concentrations. However, there is no adsorption of the main plasma proteins from PBS on “ultra-low-fouling” surfaces. It can be assumed that total resistance to the adsorption of these proteins from single-protein solutions is a prerequisite for achieving “ultra-low fouling” surface properties for blood plasma, but does not necessarily mean these properties will be achieved.

Sommaire

Results regarding the ability of SAMs to resist fouling from undiluted blood plasma and/or serum have revealed that, despite a variety of designs having low-fouling properties, the SAMs provide only a limited resistance to blood-plasma fouling. Currently, the most effective resistance has been reached with closely packed OEG6 SAMs (fouling of 500 pg mm −2 ) [8, 92]. The present state of the art does not indicate any trend of significant improvements in the low-fouling properties of SAMs-based coatings. Because of the well-established procedures and the high reproducibility of SAMs preparation, SAM surfaces can be used as an antifouling standard to compare the properties of other surfaces.

A much more effective resistance to plasma fouling has been achieved by surfaces coated with polymer brushes composed of close-packed polymer chains end-tethered to the surface. High grafting densities can be obtained by grafting linear PEG chains to surfaces under conditions that minimize the excluded volume interactions between the immobilized polymer chains, for example grafting from a solvent of poor thermodynamic quality near “cloud point” conditions or from a melt. Plasma-fouling levels as low as 20 pg mm −2 have been achieved using the latter technique [118]. The grafting of peptide-like polymers to a surface seems to provide a reasonable resistance to serum and plasma fouling [183].

The highest resistance to fouling from blood plasma has been achieved for polymer brushes grafted from a surface by SI-ATRP. Both pCBAA-2 and pHPMA brushes have non-fouling properties however, the thickness of these brushes can only be adjusted with a limited reproducibility by changing polymerization conditions. This is the result of a limited control of their SI-ATRP.

Results have confirmed that fouling from single-protein solutions does not reflect resistance of a coating to fouling from blood plasma or serum [8–10, 32, 34]. A high blood-plasma fouling has been observed on selected coatings, even though the surfaces were totally resistant to adsorption from model solutions of albumin, Fbg, or IgG, which are present in plasma at high concentrations [8–10, 92].

There remain many challenges to the precise lab-to-lab evaluation of synthetic surfaces for their antifouling properties on the basis of the measurement of plasma fouling on the surface. There is no universal blood-plasma “standard” to which the fouling can be measured and related in different experiments, or which can be used as a reference in plasma-screening measurements. The fouling is significantly different if plasma samples from different donors or pooled plasma from different sources is used [43, 192]. Therefore, plasma-fouling tests performed in different laboratories obtain rather different values resulting from the different blood-plasma samples. Table 4 summarizes fouling-level results for plasma samples collected from five different donors and pooled plasma from three different suppliers on both OEG-terminated SAMs and five antifouling brushes [192]. It was observed that even pooled plasma from a single supplier might provide different results if different batches are used.

Only experiments performed using the same batch of plasma or serum can be correctly quantitatively compared. In consequence, when developing a particular biosensor, the antifouling properties of a surface should be always evaluated in the medium relevant to applications of that specific biosensor [192].

Because the sensor sensitivity decreases with increasing physical thickness of the coating, special attention should be given to calibration of the raw sensor responses to an actual thickness and refractive index of the coating in the tested medium. However, only the thickness of dry coatings has usually been assessed, and the surface swelling in aqueous solutions or even in tested complex medium has not been considered most results therefore have not been correctly calibrated to the actual optical thicknesses of the coatings in tested media [178]. The effect of decreasing sensor sensitivity with increasing optical thickness of the coating is typically combined with a decreased fouling with increased thickness of the coating. Therefore, the minimum wet thickness to ensure antifouling properties is recommended for use in bioanalytical experiments.

In addition, it is important to mention that there are surfaces that have low-fouling properties when exposed to undiluted blood plasma however, the same surfaces have also had fouling rates below the limit of SPR detection when exposed to other biological fluids, including saliva, urine, and cerebrospinal fluid [92].

Discussion of approaches to design novel low-fouling coatings

Existing theories are not able to fully explain blood-plasma fouling on surfaces that are totally resistant to the adsorption of the main plasma proteins from model solutions (Table 3). Studies based on neutron reflectometry [40, 122, 199] and theoretical simulations [85, 123] indicate that resistance to protein adsorption correlates with the interfacial structure of water molecules arranged with an angular distribution of dipole moments bound around repeating ethylene glycol units in PEG and OEG-based coatings. Similarly, the strong hydration of the pCBAA zwitterionic moieties (having specifically arranged water molecules [200–203]) will probably contribute to the resistance of pCBAA to plasma fouling. However, the relationship between blood-plasma fouling and the chemical composition of low-fouling polymer brushes has yet to be revealed [8, 92, 192]. For example, the two surfaces totally resistant to fouling from selected undiluted blood-plasma samples, i.e. highly wettable zwitterionic pCBAA and medium-wettable pHPMA brushes, have quite different chemical structures [8]. Some studies have pointed out that most of the known surfaces resistant to single-protein solutions were decorated with kosmotrope moieties [172, 204], which could prevent the approach of a protein by a long-range interaction with the protein water shell [205]. Other studies have reported on the effect of architecture, configurational entropy, and elasticity of polymer chains in a brush [6, 36–38, 206–208]. The search for the interfacial water structures associated with some structural motifs and gradients in density and mobility of polymer chains throughout the polymer brush in relation to the fouling resistance continues to be a challenge for current research on antifouling surfaces.

A different strategy based on analysis of blood deposits on antifouling surfaces may contribute to a better understanding of plasma fouling in relation to the design of new antifouling coatings [165]. Only seven different proteins were present in plasma deposits on pHOEGMA or pMeOEGMA brushes grafted from a gold SPR surface. HSA and Fbg were both present in the deposits, despite the fact that no adsorption of these proteins from single-protein solutions in PBS was observed. Their adsorption from plasma was probably mediated by other proteins [165]. The study of plasma fouling on pHOEGMA, pHEMA, and pSBMA brushes grafted from silica particles suggested that apolipoprotein B100, which was the most concentrated protein in the deposit, was adsorbed as a part of low-density-lipoprotein (LDL) particles via interaction of LDL phospholipids with the brushes [209]. It would be useful to perform such analysis of the deposits from blood-plasma samples on other ultra-low fouling and non-fouling coatings, for example pHPMA and pCBAA, which are fully resistant to blood-plasma fouling. Such complex studies may provide new insights into factors governing the fouling of proteins from blood plasma onto synthetic surfaces, including internal wettability, mobility, flexibility, and elasticity of polymer chains. The results may contribute to the design of novel non-fouling, functionalizable coatings. In addition, alternative polymerization methods, for example SET-LRP [182], might provide better control over grafting non-fouling pCBAA and pHPMA brushes from sensor surfaces.


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