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Modèle mathématique cinétique de la glycolyse ?

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Je recherche des articles contenant des modèles mathématiques cinétiques de la glycolyse, espérons-le dans des cellules de mammifères (ou aussi proches que possible, disons de la levure). Les articles que j'ai trouvés font une analyse qualitative (bifurcations, analyse de stabilité, etc.), mais n'adaptent pas réellement le modèle aux données, vous ne pouvez donc pas être sûr de l'exactitude des constantes cinétiques impliquées. Le travail que je dois faire dépend de manière critique d'avoir des estimations raisonnablement précises de ces constantes cinétiques.


Un modèle de base cinétique du réseau de sécrétion d'insuline stimulée par le glucose des cellules β pancréatiques

La construction et la caractérisation d'un modèle cinétique de base du système de sécrétion d'insuline stimulée par le glucose (GSIS) dans les cellules β pancréatiques est décrite. Le modèle comprend 44 réactions enzymatiques, 59 variables d'état métabolique et 272 paramètres. Il intègre cinq sous-systèmes : la glycolyse, le cycle du TCA, la chaîne respiratoire, les navettes NADH et le cycle du pyruvate. Elle prend également en compte la compartimentation des réactions dans le cytoplasme et la matrice mitochondriale. Le modèle montre le comportement attendu dans ses sorties, y compris la réponse de la production d'ATP à la concentration de glucose de départ et l'induction d'oscillations des concentrations de métabolites dans la voie glycolytique et dans les concentrations d'ATP et d'ADP. L'identification des points d'étranglement et l'analyse de sensibilité des paramètres indiquent que la voie glycolytique et, dans une moindre mesure, le cycle du TCA, sont essentiels au bon comportement du système, tandis que les paramètres d'autres composants tels que la chaîne respiratoire sont moins critiques. Notamment, cependant, l'analyse de sensibilité identifie les premières réactions des voies non glycolytiques comme étant importantes pour le comportement du système. Le modèle est robuste à la suppression de l'activité de l'enzyme malique, qui est absente dans les cellules β pancréatiques de souris. Le modèle représente une étape vers la construction d'un modèle avec des paramètres spécifiques à l'espèce qui peuvent être utilisés pour comprendre les modèles murins de diabète et la relation de ces modèles murins à l'état de la maladie humaine.


Modélisation cinétique structurelle

Le comportement temporel d'un réseau métabolique, composé de m métabolites et r réactions, peut être décrit par un ensemble d'équations différentielles (6) où S désigne le mvecteur -dimensionnel de réactifs biochimiques et N les m × r matrice stoechiométrique. Les rvecteur -dimensionnel des vitesses de réaction ??(S, k) se compose de fonctions non linéaires (et souvent inconnues), qui dépendent des concentrations de substrat S, ainsi que sur un ensemble de paramètres k.

Dans ce qui suit, nous ne supposerons pas une connaissance explicite de la forme fonctionnelle des équations de taux mais visons plutôt une représentation paramétrique du Jacobien du système. Comme seule hypothèse mathématique sur le système, nous exigeons l'existence d'un état positif S 0 qui remplit la condition de régime permanent Non(S 0 , k) = 0. A noter que l'état S 0 n'a pas besoin d'être unique ou stable.

En utilisant les définitions (16, 17) avec je = 1, …, m et j = 1, …, r et en appliquant la substitution de variable Sje = X je S je 0 , le système peut être réécrit en termes de nouvelles variables X(t)

Le Jacobien correspondant du système normalisé à l'état stationnaire X 0 = 1 est parce que les nouvelles variables X sont liés à S par une constante multiplicative simple, JX peut être directement retransformé dans le jacobien original.

Toute évaluation ultérieure du Jacobien repose maintenant sur l'interprétation des termes de l'équation. 4 . Commençons par une analyse de la matrice ??: Ses élémentsje ont les unités d'un temps inverse et sont constitués des éléments de la matrice stoechiométrique N, le vecteur des concentrations à l'état d'équilibre S 0 , et les flux en régime permanent ??(S 0 ). À condition qu'un système métabolique soit désigné pour la modélisation mathématique, nous pouvons supposer qu'il existe des connaissances sur les concentrations pertinentes, c'est-à-dire que pour chaque métabolite, nous pouvons spécifier un intervalle S je − ≤ S je 0 ≤ S je + , qui définit une plage physiologiquement réalisable de la concentration respective. De plus, les flux permanents ??(S 0 ) sont soumis à la contrainte de bilan massique Non(S 0 ) = 0, ne laissant que r − rang(N) des vitesses de réaction indépendantes (6). Encore une fois, un intervalle νje − ≤ νje 0 νje + peut être spécifié pour toutes les vitesses de réaction indépendantes, définissant un espace de flux physiologiquement admissible.

Dans la suite, on note S 0 et ??(S 0 ), correspondant généralement à un état observé expérimentalement du système, en tant que « point de fonctionnement » auquel le Jacobien doit être évalué. Cette information, ainsi que la matrice stoechiométrique N, spécifie complètement la matrice ??.

L'interprétation de la matrice ?? X ?? dans l'éq. 4 est légèrement plus subtile car elle implique les dérivées des fonctions inconnues ??(X) par rapport aux nouvelles variables normalisées au point X 0 = 1. Néanmoins, une interprétation de ces paramètres est possible et ne repose pas sur la connaissance explicite de la forme fonctionnelle détaillée des équations de taux : Chaque élément θXje ??j de la matrice ?? X ?? mesure le degré de saturation normalisé de la réactionj par rapport à un substrat S je au point de fonctionnement S 0 . En particulier, la dépendance de presque toutes les lois de vitesse biochimiques νj(S) sur un réactif biochimique S je peut s'écrire sous la formej(S, k) = k v S je m /F m(S, k), où m désigne un exposant entier et F m(S, k) un polynôme d'ordre m dans S je avec des coefficients positifs k. Tous les autres réactifs ont été absorbés dans k (6). Après avoir appliqué la transformation de l'équation. 2 , on obtient

avec α ∈ [0, 1] désignant une variable libre dans l'intervalle unitaire. Les cas limites sont toujours limSje 0 →0 = 1 et limSje 0 →∞ α = 0. Pour évaluer la matrice ?? X ?? , nous restreignons ainsi chaque paramètre de saturation à un intervalle bien défini, spécifié de la manière suivante : Comme pour la plupart des lois de vitesse biochimiques m = m = 1, la dérivée partielle prend généralement une valeur comprise entre zéro et l'unité, déterminant le degré de saturation de la réaction respective. Dans le cas du comportement coopératif avec les exposants m = m ≥ 1, la dérivée partielle normalisée se situe dans l'intervalle [0, m] et, de manière analogue, dans l'intervalle [0, −m] pour l'interaction inhibitrice avec m = 0 et m ≥ 1. Pour des exemples et la preuve de l'équation. 5 , voir, respectivement, Matériaux et méthodes et le Annexe à l'appui et Fig. 8–11, qui sont publiés en tant qu'informations complémentaires sur le site Web du PNAS.

Les matrices ?? X ?? et ??, comme défini ci-dessus, spécifient complètement le Jacobien du système. Dans ce qui suit, les deux grandeurs sont traitées comme des paramètres libres, définissant l'« espace de paramètres » physiologiquement admissible du système. Il est important de noter que notre représentation du Jacobien remplit les trois conditions essentielles suivantes. (je) Le Jacobien reconstruit représente le Jacobien exact à ce point dans l'espace des paramètres. Il n'y a pas d'approximation impliquée. (ii) Chaque terme du Jacobien est soit directement accessible expérimentalement, comme les valeurs de flux ou de concentration, soit a une interprétation biochimique bien définie, comme un degré de saturation normalisé d'une réaction donnée. (iii) Le Jacobien ne dépend pas d'un choix particulier de fonctions de taux spécifiques. Au contraire, il englobe tous les modèles cinétiques possibles du système qui sont cohérents avec les considérations ci-dessus. En ce sens, le Jacobien reconstruit est exhaustif.


Les équations de base utilisées pour l'analyse dynamique

Les bilans massiques dynamiques

La reconstruction d'un réseau réactionnel à l'échelle du génome nécessite l'identification de tous ses composants chimiques et les transformations chimiques auxquelles ils participent. Ce processus repose principalement sur des génomes annotés et une évaluation bibliomique détaillée (Reed et al, 2006 ). Le résultat de ce processus est la matrice stoechiométrique, S, qui est utilisé dans les bilans massiques dynamiques

qui sont à la base de tous les modèles cinétiques. Ici d(.)/dt désigne la dérivée temporelle, X est le vecteur des concentrations des composés dans le réseau et v(X) est le vecteur des vitesses de réaction. Toutes les transformations biochimiques sont fondamentalement uni- ou bi-moléculaires. De telles réactions peuvent être représentées par une cinétique d'action de masse, ou des généralisations de celle-ci (Segel, 1975). Le taux de réaction net pour chaque réaction élémentaire dans un réseau peut être représenté par la différence entre un flux direct et inverse (par exemple, voir la figure 1).

Cette formulation couramment utilisée repose sur plusieurs hypothèses bien connues, telles que la température, le volume et l'homogénéité du milieu constants. Si S, v(x) et les conditions initiales (X0) sont connues, alors ces équations différentielles ordinaires peuvent être résolues numériquement pour un ensemble de conditions d'intérêt.

Forme linéaire

La caractérisation des états dynamiques des réseaux peut être étudiée par simulation numérique ou par analyse mathématique. Une simulation dépend du contexte et représente une étude de cas. Les méthodes mathématiques pour l'analyse des caractéristiques du modèle reposent généralement sur l'étude des propriétés de la transformation entre les concentrations et les flux. L'analyse de ces propriétés fondamentales repose normalement sur la linéarisation des équations gouvernantes à une condition définie. La linéarisation des équations du bilan massique dynamique se résume à la linéarisation du vecteur vitesse de réaction pour former la matrice de gradient

puis formation de la matrice Jacobienne à un état de référence Xréf:

X′=XXréf et J est la matrice Jacobienne bien connue. L'analyse des caractéristiques de la matrice jacobienne est une procédure standard dans l'analyse mathématique de la dynamique du système (par exemple Strogatz, 1994). L'application de ces méthodes à des réseaux biochimiques est réalisée depuis des décennies (Heinrich et al, 1977 , 1991 Heinrich et Sonntag, 1982 Palsson et al, 1987 ) et ces dernières années il y a eu un regain d' intérêt et récemment de nouveaux développements dans l' analyse dynamique des propriétés de J sont apparus ( Teusink et al, 2000 Kauffman et al, 2002 Famille et al, 2005 Bruges et al, 2006 Steuer et al, 2006 Grimb et al, 2007 ).

La matrice Jacobienne pour les réseaux de réactions biochimiques est le produit de deux matrices de données. Avant d'examiner les propriétés fondamentales de J, nous considérons les workflows et les propriétés de données qui se rapportent à S et g.


2. Matériels et méthodes

2.1. Structure du modèle et implémentation numérique

Nous avons construit un modèle cinétique du métabolisme des cellules cancéreuses du pancréas en utilisant des modèles de métabolisme précédemment publiés de divers types de cellules (Mulukutla et al., 2010 Marín-Hernández et al., 2011 Mulukutla et al., 2012 Marín-Hern& #x000E1ndez et al., 2014 Shestov et al., 2014 Mulukutla et al., 2015). Notre modèle comprend un total de 46 métabolites et 53 réactions enzymatiques dont la glycolyse, la glutaminolyse, le cycle du TCA, le PPP et les navettes malate-aspartate-cétoglutarate-glutamate entre les compartiments cytosolique et mitochondrial (Figure 1). Chaque étape de la voie métabolique est modélisée selon des réactions enzymatiques connues, qui incluent des mécanismes de réaction allant du simple Michaelis-Menten à une cinétique bi-bi aléatoire compliquée, exprimée sous différentes formulations mathématiques. Les lois de vitesse pour chaque mécanisme de réaction sont incorporées dans un système de 46 équations différentielles ordinaires (ODE) non linéaires qui décrivent comment les concentrations de métabolites évoluent au fil du temps. Il existe une seule ODE pour chaque métabolite, représentant la vitesse de changement de la concentration en espèces, qui dépend des vitesses auxquelles l'espèce est produite et consommée dans le réseau réactionnel. Nous avons utilisé un solveur d'équation différentielle implicite dans MATLAB (Guide, 1998) pour intégrer numériquement les équations et résoudre les concentrations de métabolites. Il s'agit d'un modèle déterministe, qui simule les concentrations dans un ensemble homogène de cellules qui subissent, en moyenne, des conditions environnementales intra- et extra-cellulaires similaires. En intégrant les ODE, nous calculons la dynamique moyenne de la population cellulaire.

Figure 1. Schéma du modèle. Le réseau métabolique est composé de 46 métabolites interagissant à travers 53 réactions enzymatiques. Les voies principales impliquent la glycolyse, la glutaminolyse, le cycle du TCA, le PPP et les réactions de navette entre les compartiments mitochondriaux (rectangle ombré) et cytoplasmique. Les abréviations des métabolites, cofacteurs et enzymes sont données dans le fichier supplémentaire S3. Les nœuds colorés représentent les métabolites pour lesquels le facteur de changement a été mesuré expérimentalement pendant le knockdown de l'enzyme GOT1 (indiqué en rouge). Les flèches représentent la direction des flux de réaction dans le modèle de base au début de la simulation.

Nous résumons brièvement les équations du modèle ci-dessous, et l'ensemble complet des EDO est fourni dans le matériel supplémentaire (fichiers de modèle : “S1.m” et “S2.xml”). Les abréviations des métabolites et les noms des réactions sont données dans le fichier supplémentaire S3 et les valeurs des paramètres fixes sont répertoriées dans le fichier supplémentaire S4. Les équations de vitesse détaillées pour la glycolyse et leurs constantes cinétiques correspondantes sont principalement basées sur le modèle de glycolyse pour les cellules HeLa (Marín-Hernández et al., 2011, 2014). Ce réseau de réactions de glycolyse a été étendu pour inclure les réactions du cycle TCA et PPP en utilisant les lois de vitesse cinétique et les paramètres de Mulukutla et de ses collègues (Wu et al., 2007 Mulukutla et al., 2010, 2012, 2015). Les réactions impliquant la consommation et la production d'ATP dans le cytoplasme ont été définies comme dans le modèle de Chestov et al. (2014), et les concentrations d'ATP et d'ADP dans le compartiment mitochondrial ont été maintenues constantes comme dans Mulukutla et al. De plus, les paramètres de transport de la glutamine ont été obtenus de Pingitore et al. (2013).

L'AKT est un puissant promoteur de la tumorigénicité du cancer du pancréas médiée par KRAS (Asano et al., 2004) en raison de son influence sur les taux de réactions métaboliques dans la glycolyse. Il est connu que les cellules PDAC ont une absorption accrue de glucose (Ying et al., 2012), qui est médiée par la régulation à la hausse d'enzymes glycolytiques spécifiques, notamment le glucose transporter-1 (GLUT1), l'hexokinase (HK) et la lactate déshydrogénase A (LDHA ). De plus, AKT favorise une absorption accrue du glucose en activant GLUT1, HK et l'enzyme phosphofructokinase (PFK) (Rathmell et al., 2003 Elstrom et al., 2004). Nous avons incorporé l'effet de l'AKT dans notre modèle métabolique, simulant l'activité glycolytique améliorée médiée par l'AKT. Plus précisément, les activités des enzymes GLUT1, HK et PFK (représentées par leur Vmax valeurs) sont modélisées pour avoir 20 % d'activité basale, tandis que 80 % de leur activité est due à l'activation par AKT (Mosca et al., 2012 Mulukutla et al., 2012).

Afin de prédire comment les voies métaboliques intracellulaires influencent la croissance cellulaire, nous intégrons le nombre de cellules aux réactions catalysées par des enzymes. Plus précisément, le modèle est augmenté pour inclure une 47e ODE qui décrit l'évolution temporelle du nombre de cellules cancéreuses, CN. La croissance cellulaire est mise en œuvre comme une équation logistique (Enderling et Chaplain, 2014) qui rend compte de la capacité de charge maximale de la tumeur, KCC (Équation 1).

Le nombre de cellules cancéreuses est directement lié au métabolisme, où le taux de croissance dépend des concentrations intracellulaires de trois métabolites primaires connus pour influencer la prolifération cellulaire : le glucose, la glutamine et l'ATP (Venkatasubramanian et al., 2008 Zhu et al., 2012) . La dépendance vis-à-vis de ces trois métabolites est modélisée en supposant des fonctions de type Monod (Higuera et al., 2009) (Équation 2).

Les paramètres de croissance et de mort αatp, αglc, αgln, et α sont dans les unités de min 𢄡 . Les paramètres de concentration kgc, kgn, et kap ont des unités de mM.

2.2. Conditions initiales

Nous avons simulé le modèle avec plusieurs ensembles de concentrations de métabolites de départ pour identifier la plage appropriée de conditions initiales. Il existe peu d'informations concernant les concentrations initiales de métabolites intracellulaires dans les cellules cancéreuses du pancréas. Par conséquent, nous avons laissé la concentration initiale de chaque métabolite varier dans une plage spécifiée. Nous avons spécifié les plages de concentration sur la base des mesures publiées obtenues à partir de diverses lignées cellulaires, y compris le cancer du col de l'utérus humain (Marín-Hernández et al., 2011, 2014), des échantillons de tissus normaux malades et environnants provenant de patients atteints de cancer de l'estomac et du côlon (Hirayama et al., 2009), extraits de cellules de cancer du sein (Le Guennec et al., 2012), échantillons de patients atteints de cancer PDAC (Fontana et al., 2016) et lignées cellulaires myélome de souris et CHO (Mulukutla et al., 2012, 2015) . Une incertitude supplémentaire pour les cellules cancéreuses du pancréas a été prise en compte en augmentant et en diminuant les limites supérieure et inférieure, respectivement, de 20 %. En raison du manque de mesures qui distinguent les niveaux de métabolites dans différents compartiments cellulaires, les concentrations initiales de métabolites qui étaient présentes dans les compartiments mitochondriaux et cytosoliques ont été supposées être les mêmes. Les plages de concentrations de métabolites indiquées dans le tableau 1 tiennent compte de la variabilité des mesures de la littérature ainsi que d'une incertitude supplémentaire pour la concentration intracellulaire inconnue des lignées cellulaires du cancer du pancréas en particulier.

Tableau 1. Bornes des conditions initiales utilisées dans les simulations du modèle.

L'échantillonnage Latin Hypercube (McKay et al., 2000 Oguz et al., 2013) a été appliqué à l'échantillon dans les plages sélectionnées pour chaque métabolite. LHS sépare la gamme de concentrations des métabolites en plusieurs intervalles et échantillons de chaque intervalle exactement une fois, explorant ainsi efficacement toute la gamme possible de conditions initiales pour chaque métabolite. Nous avons choisi d'obtenir 100 ensembles de conditions initiales pour chaque métabolite pour l'analyse d'identifiabilité des paramètres (section 3.1.1), puis sélectionné au hasard 50 de ces ensembles à utiliser dans l'estimation des paramètres (section 3.1.3). Cette procédure explore de manière adéquate les plages possibles de conditions initiales tout en équilibrant les ressources de calcul requises pour l'optimisation globale des paramètres.

2.3. Estimation des paramètres

Le modèle de base, adapté de la littérature, a un total de 372 paramètres, qui comprend 71 vitesses de réaction (les vitesses avant et arrière, VF et Vr, respectivement). Les vitesses de réaction reflètent la quantité d'enzyme présente et l'activité enzymatique correspondante. Classiquement, on pense que les vitesses de réaction distinguent le métabolisme à travers différents types de cellules. Par conséquent, parmi les nombreux paramètres cinétiques inclus dans les équations de vitesse de réaction, seules les vitesses de réaction ont été adaptées aux données d'apprentissage, et les autres constantes de vitesse ont été maintenues à leurs valeurs de la littérature. Nous adaptons également les paramètres de croissance cellulaire indiqués dans les équations (1) et (2). Ci-dessous, nous décrivons les données expérimentales utilisées pour entraîner le modèle et la méthode utilisée pour effectuer l'estimation des paramètres.

Le modèle est adapté aux mesures expérimentales de Son et al. (2013), qui ont mesuré les concentrations de 14 métabolites intracellulaires à l'aide d'une analyse métabolomique ciblée. Son et ses collègues ont cherché à comprendre le métabolisme non canonique de la glutamine dans les cellules cancéreuses du pancréas après le knockdown de GOT1, une enzyme majeure dans le métabolisme de la glutamine. Les concentrations de métabolites ont été mesurées lorsque l'enzyme GOT1 a été renversée, par rapport à la condition d'absence de renversement. Ainsi, ils ont quantifié le facteur de changement dans les concentrations de métabolites.

Le protocole expérimental utilisé par Son et ses collègues est illustré à la figure S1. Nous avons simulé la même séquence d'étapes pour prédire le facteur de changement dans les concentrations des 14 métabolites. Étant donné que le niveau d'expression enzymatique relatif peut être corrélé avec la régulation des niveaux d'activité enzymatique, nous simulons le knockdown enzymatique en multipliant le VF par le facteur (1 - α) (Nolan et Lee, 2012). Nous considérons que la valeur de α est de 0,85, sur la base du niveau d'expression moyen de GOT1 à partir de deux expériences de précipitation rapportées dans Son et al. (2013). Le modèle est simulé pour le knockdown de GOT1 afin de prédire le facteur de changement de la concentration des 14 métabolites par rapport au cas sans knockdown. Nous avons cherché à minimiser la somme pondérée de l'erreur au carré (WSSR) entre les données expérimentales et les prédictions du modèle.

De plus, Son et ses collègues utilisent in vitro culture cellulaire pour étudier comment le métabolisme intracellulaire influence la prolifération cellulaire. Ils mesurent le nombre de cellules avec et sans knockdown GOT1 et en présence de différentes concentrations de nutriments extracellulaires. Nous simulons également leurs protocoles expérimentaux et comparons les prédictions du modèle à leurs mesures expérimentales.

L'optimisation de l'essaim de particules (PSO) a été utilisée pour identifier les valeurs des paramètres nécessaires pour permettre aux prédictions du modèle de s'adapter au mieux aux données et de minimiser le WSSR. PSO (Iadevaia et al., 2010 Kennedy, 2010 Tashkova et al., 2011) est une technique d'optimisation globale stochastique d'inspiration biologique développée par Kennedy et Eberhart (1995). Il est basé sur le concept du comportement social observé dans la nature. Dans PSO, de nombreux particules, ensembles de paramètres, sont constamment mis à jour à partir de leurs valeurs de départ aléatoires pour identifier les valeurs de paramètres qui correspondent le mieux aux données expérimentales. Chaque particule a une position, représentant l'emplacement dans l'espace multidimensionnel des paramètres, et une vitesse avec laquelle elle se déplace vers un minimum local dans le WSSR. Les particules communiquent entre elles pour mettre à jour leur position et leur vitesse, se déplaçant finalement vers le minimum global dans le WSSR. Nous avons utilisé PSO pour estimer les vitesses de réaction pour le modèle de base. Chaque particule représente un vecteur de toutes les vitesses de réaction à optimiser où les valeurs initiales des paramètres sont extraites d'un espace bien échantillonné avec les limites données. Pour spécifier les limites, les vitesses de réaction ont pu varier de 100 fois vers le haut et vers le bas par rapport à leurs valeurs de départ (tirées de la littérature, voir Matériels et méthodes). Chaque exécution de l'algorithme PSO exécute 2 500 itérations, une valeur définie par l'utilisateur pour équilibrer les dépenses de calcul de la recherche de paramètres. Nous avons effectué l'estimation des paramètres deux fois pour chaque ensemble de conditions initiales (c'est-à-dire un total de 5 000 itérations par condition initiale) et, pour chaque cas, nous avons sélectionné l'ensemble de paramètres qui a généré l'erreur la plus faible. Cela a donné un total de 50 ensembles de paramètres les mieux adaptés, un ensemble pour chaque condition initiale.

L'estimation des vitesses de réaction pour chaque condition initiale était la première étape de l'ajustement du modèle. Dans la deuxième étape de l'ajustement du modèle, nous avons cherché à estimer les paramètres de croissance en minimisant le WSSR. Comme il y a moins de paramètres à ajuster par rapport à la première étape d'ajustement, nous avons utilisé une optimisation des moindres carrés non linéaire. Nous avons effectué l'ajustement 100 fois pour chaque condition initiale afin d'approcher le minimum global de l'erreur du modèle. Compte tenu des connaissances préalables limitées de la plage de valeurs de base pour les paramètres de croissance (Higuera et al., 2009), nous avons effectué des recherches dans un espace de paramètres couvrant sept ordres de grandeur pour chaque paramètre. Les simulations du modèle pour optimiser la croissance cellulaire ont été menées de telle sorte que le même ensemble de sept paramètres de croissance puisse s'adapter à la courbe de croissance expérimentale pour les conditions d'absence de précipitation et de précipitation GOT1.

2.4. Extraction de données

Les données expérimentales pour la formation et la validation du modèle ont été extraites de Son et al. (2013) en utilisant le programme MATLAB GRABIT (Guide, 1998). Les données d'entraînement incluent le facteur de changement des concentrations de métabolites et du nombre de cellules sous le knockdown GOT1. Les données de validation incluent le numéro de cellule sous privation de nutriments.

2.5. Analyse d'identifiabilité des paramètres

Nous avons utilisé une analyse d'identifiabilité des paramètres structurels (Maly et Petzold, 1996 Ascher et Petzold, 1998 Shampine et al., 1999 Finley et al., 2011 Berthoumieux et al., 2013) pour réduire le nombre de paramètres du modèle ajustés aux données d'apprentissage. L'identifiabilité des paramètres détermine les dépendances implicites entre les paramètres. Si deux paramètres sont corrélés, nous pouvons spécifier une relation mathématique entre les paramètres et n'en adapter qu'un seul dans la procédure d'estimation des paramètres. Ici, nous spécifions uniquement la relation entre les vitesses de réaction directe et inverse corrélées, où la vitesse de réaction inverse, Vr, est exprimé en fonction de la vitesse de réaction directe, VF, avec la constante d'équilibre, Véq: Vr = VF/Véq. Dans ces cas, seule la vitesse de réaction directe est ajustée aux données expérimentales, réduisant ainsi le nombre de paramètres ajustés. Les Véq est calculé à partir des travaux publiés à partir desquels notre modèle est dérivé (Wu et al., 2007 Mulukutla et al., 2010, 2012, 2015 Marín-Hernández et al., 2011, 2014).

2.6. Analyse de sensibilité

Nous avons appliqué une analyse de sensibilité globale (Saltelli et al., 2008) pour déterminer lequel des paramètres du modèle influence le plus significativement les concentrations de métabolites prévues. Plus précisément, nous avons utilisé la méthode étendue du test de sensibilité d'amplitude de Fourier (eFAST) (Marino et al., 2008), une approche basée sur la variance, pour comprendre la robustesse des sorties du modèle (concentrations de métabolites) compte tenu de la variance dans les entrées du modèle (la réaction vitesses) (Zi, 2011). Nous avons laissé les entrées du modèle varier de deux ordres de grandeur vers le haut et vers le bas par rapport aux valeurs de la littérature. La méthode eFAST calcule deux indices qui fournissent une estimation de la sensibilité des sorties du modèle par rapport aux paramètres du modèle. L'indice de premier ordre, Sje, quantifie la variance de la sortie du modèle par rapport aux variances de chaque entrée individuelle, et l'indice FAST total, Sti, quantifie la variance de la sortie du modèle par rapport aux variances de chaque entrée et aux covariances entre les combinaisons d'entrées. Les Sje, alors, est une mesure de la sensibilité locale de la sortie du modèle à chaque entrée individuelle, alors que Sti est une mesure de la sensibilité globale, tenant compte des interactions ou des corrélations entre plusieurs entrées.


Discussion

Considérations générales

Dans ce travail, nous avons utilisé un modèle cinétique détaillé du métabolisme hépatique du glucose pour étudier la contribution du foie à l'homéostasie de la glycémie dans des conditions physiologiques et pathologiques. Nous avons validé le modèle en comparant les simulations du modèle avec une variété de données expérimentales sur les flux d'échange de glucose, les concentrations de métabolites et le remplissage/vidage de la réserve de glycogène intrahépatique. Notre objectif central était de disséquer l'importance relative des mécanismes individuels de régulation enzymatique pour la réponse adéquate du foie à divers niveaux de glucose plasmatique. La conclusion générale de cette analyse est que les changements dans l'état de phosphorylation induite par les hormones des enzymes régulatrices clés ainsi que les changements dans la concentration des effecteurs allostériques sont au moins de la même importance que les changements dans l'abondance des enzymes pour l'ajustement de la production métabolique. à la demande métabolique définie par les conditions extérieures. La forte influence des régulateurs au-delà des changements dans l'abondance des protéines est probablement la principale raison de la faible corrélation habituellement observée entre les flux métaboliques et l'abondance des enzymes catalysantes associées.

La nécessité d'une action concertée des différents modes de régulation enzymatique peut être motivée en considérant que même des défis extrêmement élevés à l'adaptation du métabolisme cellulaire (par exemple pendant les périodes de famine ou de surnutrition, d'exposition à des agents toxiques, d'inflammation ou de prolifération) ne sont jamais constants. au fil du temps mais fluctuant, et ne peut donc pas être atteint en augmentant ou en diminuant simplement l'abondance des enzymes. Par conséquent, il est juste d'affirmer que tout concept théorique visant à une meilleure compréhension de la régulation des réseaux métaboliques doit prendre en compte la régulation des activités enzymatiques au-delà du niveau d'expression des gènes.

Conséquences fonctionnelles des modifications de l'abondance des protéines lors de la transition entre les états nutritionnels à jeun et nourri et dans le diabète

Tout d'abord, nous avons analysé comment les changements dans l'abondance des enzymes métaboliques clés signalés pour le foie de rat dans des conditions nutritionnelles à jeun et nourries influencent la production métabolique dans diverses conditions physiologiques. Les changements dans l'abondance des enzymes régulatrices clés des voies glycolytiques et gluconéogéniques se sont avérés entraîner des différences significatives dans la relation entre les niveaux de glucose plasmatique et les flux d'échange hépatique de glucose - le foie « à jeun » devient un producteur de glucose plus fort, tandis que le « nourri » le foie devient un plus grand utilisateur de glucose. Cette adaptation est réalisée par des changements d'abondance enzymatique et est avantageuse pour l'homéostasie du glucose plasmatique tant que la situation physiologique anticipée persiste. Cependant, cela peut devenir un inconvénient si un changement soudain (inattendu) se produit. Un foie adapté à un jeûne de 1 à 2 jours est moins préparé à répondre à une forte augmentation soudaine de la glycémie qu'un foie dont la glycémie est continuellement élevée (Fig. 15). Une complication clinique bien connue survenant lors de la réalimentation chez les patients fortement dénutris est l'intolérance au glucose [12], un type de dérégulation métabolique qui survient généralement dans les premiers stades du diabète de type 2. Conformément à cette observation, la relation entre les taux de glucose plasmatique et hépatique les taux d'échange de glucose prédits par le modèle sont très similaires dans les conditions de jeûne et de diabète (Fig. 10), c'est-à-dire que la néoglucogenèse est augmentée et la capacité glycolytique réduite.

Production et utilisation diurnes de glucose par le foie

Les taux de HGP et HGU dépendent du niveau plasmatique de nutriments et d'hormones qui changent en permanence au cours de la journée. En prenant en entrée les profils plasmatiques diurnes mesurés, le modèle cinétique permet de simuler les changements diurnes de HGP et HGU et l'état de remplissage en glycogène (Figs. 12, 13 et 14). Ces simulations montrent que, dans l'état nutritionnel nourri, le foie est capable de basculer entre HGP et HGU. Pendant la journée, le foie fonctionne principalement comme un utilisateur de glucose et pendant la nuit, il est un producteur de glucose. Selon le moment de la prise alimentaire et la durée et l'intensité de l'exercice physique, les profils métaboliques individuels peuvent différer significativement du profil générique utilisé comme entrée pour nos simulations. Contrairement à l'état nourri, pendant la famine à long terme, le foie devrait fonctionner en permanence comme un producteur de glucose pour s'assurer que les niveaux de glucose plasmatique restent suffisamment élevés pour alimenter les consommateurs de glucose obligatoires tels que le cerveau et les érythrocytes. Dans le cas diabétique, des altérations de l'abondance enzymatique des enzymes glycolytiques et gluconéogénétiques ainsi qu'une altération des réponses hormonales du glucose conduisent à une évolution pathologique vers la néoglucogenèse (Fig. 11). La bonne concordance entre le décalage du point de consigne et les taux de glucose plasmatique observés souligne l'importance du foie dans la détermination des taux de glucose plasmatique. Ces différences fondamentales dans les états métaboliques basaux du foie se reflètent également dans les états de remplissage en glycogène. A l'état nutritionnel nourri, le glycogène est dégradé lors de l'HGP et reconstitué lors de l'HGU, le remplissage des réserves de glycogène variant ainsi entre 50 % et 80 % de la capacité totale de stockage. A jeun, l'état de remplissage global de la réserve de glycogène est beaucoup plus faible et varie entre 10 % et 25 % seulement.

Évaluation de l'importance relative de l'abondance variable des enzymes et de la régulation cinétique des activités enzymatiques pour la régulation des taux d'échange hépatique du glucose

To investigate the relative importance of the different regulation modes of enzyme activities we simulated the glucose exchange flux of the liver for different nutritional states (Fig. 16 and Table 2). In the fed state, the strongest regulatory influence is exerted by the changes of enzyme abundances, whereas in the fasted state, reversible phosphorylation has the largest impact. An important finding is that the short-term metabolic adaptation of the liver can be largely attributed to hormonal regulation as the glucose exchange fluxes become almost constant when we fix the phosphorylation state of the interconvertible enzymes. Nevertheless, the impact of allosteric regulation is substantial both in the fasted and the fed state, accounting for approximately 50 % of flux changes brought about by reversible phosphorylation in the fasted and fed state, respectively. It has to be noted that the role of allosteric regulation is certainly underestimated in our model as the concentration values of important cofactors (adenosine tri-/di-/monophosphate, nicotinamide adenine dinucleotide, and its reduced form NADH) and of allosterically important metabolites of the citric acid cycle (e.g. citrate inhibition of the phosphofructokinase) were not taken into account.

Metabolic control analysis (MCA)

To dissect the importance of individual enzymes for hepatic glucose exchange rates under different conditions we used the MCA concept. Calculation of flux control coefficients for the ‘fed’ and ‘fasted’ states revealed that enzymes carrying significant control are those showing significant changes of their abundance under different physiological conditions. Furthermore, the flux control is shared between different groups of enzymes in different conditions – enzymes being important in the glycolytic phase of liver metabolism are different from the ones central during gluconeogenesis (Table 3). Importantly, the control coefficients for the glucose exchange flux exhibit significant fluctuation over one day and diverge (by definition) when the glucose exchange flux is zero (Fig. 17).

We also calculated π-elasticity coefficients to quantify the relative share of reversible phosphorylation and concentration changes of reactants and allosteric effectors in the regulation of individual enzymes of hepatic glucose metabolism (Fig. 18). This analysis revealed a large variability in the relative contribution of the three fast regulatory modes to the control of regulatory enzymes and hence the control of glucose exchange flux.

Direct experimental validation of the computed elasticities in vivo is unfeasible because this would require monitoring of the glucose exchange flux of the liver at clamped plasma levels of glucose and hormones in response to the gradual variation of an effector specifically influencing one kinetic parameter of the target enzyme under study. As a surrogate, we checked whether the predicted elasticities are concordant with observed changes in plasma glucose levels induced by targeting a single key regulatory enzyme either by drugs or genetic interventions.

The maximal control that can be exerted by GK is low in the fasted-hypoglycemic state but becomes large in the fed-hyperglycemic state. Experimentally, glucosamine-induced inhibition of GK caused only marginal reduction of glucose uptake in euglycemia, whereas in hyperglycemia a significant reduction of the net hepatic glucose uptake of about 40 % was observed [13], confirming our simulation results. Clinically, the regulatory importance of GK in hyperglycemia is used to target this enzyme in diabetes type 2 [14, 15].

Glycogen phosphorylase (GP)

Torres et al. [16] investigated the effects of a GP inhibitor (GPje) and metformin on hepatic glucose in presence of basal and four-fold increased levels of plasma glucagon in 18-h fasted conscious dogs. In euglycemic conditions, no change in the net hepatic glucose balance and plasma glucose was observed in the presence of GPje. However, after glucagon stimulation, the presence of GPje significantly diminished the glucose output. Both findings confirm the predicted relatively high control of the GP in hypoglycemic conditions as well as the large share of allosteric regulation of this enzyme.

Phosphofructokinase-1 (PFK1)

To our knowledge, a rate-limiting role of this enzyme in the liver is not reported. In several non-hepatic tissues, PFK1 exerts only insignificant control of glycolytic flux [17], which agrees with the predicted very small values of control coefficients in both the hypo- and hyperglycemic cases.

PFK2/FBP2

The enzyme PFK2/FBP2 exerts control of the glucose exchange flux mainly by changes in its phosphorylation state, whereas changes in the abundance of this enzyme have no impact of the glucose exchange flux. The reason for the latter is the bifuncionality of this enzyme – the phosphorylated enzyme (PFK2) acts as a kinase catalyzing the formation of fructose 2,6-bisphosphate (Fru26P2), an efficient allosteric activator of PFK1, whereas the non-phosphorylated enzyme (FBP2) acts as a phosphatase catalyzing the degradation of Fru26P2 to fructose 6-phosphate (Fru6P). These two opposite reactions create a futile cycle Fru6P → Fru26P2 → Fru6P that consumes one molecule of ATP. Obviously, unequal modulation of these opposite activities cannot be achieved by changes of protein abundance because any change in enzyme amount influences both activities to the same extent and thus leaves the net flux unchanged. However, reversible phosphorylation enhances FBP2-activity and in parallel diminishes the PFK2-activity of this enzyme, resulting in a high sensitivity of the glucose exchange flux to changes in the phosphorylation state of the PFK2/FBP2.

Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK)

Metabolic control of liver gluconeogenesis was quantified in groups of mice with varying PEPCK protein content. Surprisingly, livers with a 90 % reduction in PEPCK content showed only a 40 % reduction in gluconeogenic flux, indicating a lower than expected capacity for PEPCK protein content to control gluconeogenesis (estimated control coefficient of about 0.18) [18]. This is in good agreement with our theoretical predictions. She et al. [18] concluded that the liver PEPCK functions more as an integrator of hepatic energy metabolism than as a determinant of gluconeogenesis.

Knowledge of the flux control exerted by a specific enzyme and of the regulatory mechanisms that contribute to its control is valuable information for the design of new drugs. For example, our analysis revealed that changing the protein abundance of the bifunctional enzyme PFK2/FBP2 should have no influence on the stationary glucose exchange flux of hepatocytes. Hence, drugs targeting this enzyme as non-competitive inhibitors can be expected to have little impact on the modulation of the hepatic glucose exchange flux. However, our analysis suggests that drugs specifically targeting only the phosphorylated enzyme (phosphatase) or non-phosphorylated enzyme (kinase) have a strong impact on the glucose exchange flux. These theoretical findings are supported by the fact that cancer cells express a specific phosphatase (TIGAR) that catalyzes the degradation of the glycolytic activator Fru26P2 in order to suppress glycolysis and to redirect the glucose flux through the oxidative pentose phosphate pathway. Flux control by PFK2/FBP2 may serve as a good example of why up or down regulation of the abundance of an enzyme does not necessarily imply corresponding flux changes as is assumed in numerous publications dealing with the potential metabolic consequences of varying protein abundances.


Fond

A kinetic model of a biochemical reaction network consists of a set of ordinary differential equations describing the dynamics of the concentrations of all metabolites in the reaction network. Most biochemical reaction networks are complex and involve many enzyme-catalyzed processes with non-linear kinetics and intricate stoichiometric and regulatory interactions between the enzymes. Consequently, the mathematical models of such networks contain high-dimensional sets of coupled rational differential equations, which sometimes require huge computational effort to analyze. The current state-of-the-art numerical tools for stability analysis, for bifurcation study and for other types of dynamical analysis are known to suffer from a so-called curse-of-dimensionality. For example, the largest biological model that has numerically been analyzed for bifurcation in[1] consists of 25 metabolites and 37 parameters and the one in[2] has 22 metabolites. Moreover since complex models of biochemical reaction networks involve a huge number of parameters, the task of identifying these parameters (in addition to those parameters that have been identified in the literature) is enormous and requires large datasets. The complexity of this task is further compounded by the fact that often not all the metabolite concentrations can be measured. Thus, there is a need for techniques that can reduce a given kinetic model of a biochemical reaction network to a simplified version that mimics the behaviour of the original model satisfactorily, but contains less differential equations and parameters.

For biochemical reaction networks, a number of model reduction techniques are known. See[3] for a detailed review of some of the well known methods of model reduction. Here we list only a few of the known methods in the literature. The singular perturbation method, the time-scale separation technique[4–8], the rapid-equilibrium approximation, also known as the quasi-equilibrium approximation (see[9]) and the quasi steady-state approximation (QSSA) (see for e.g.,[10]) are the most commonly used techniques. The reduced state vector obtained by any of these techniques contains a subset of the metabolite concentrations (state vector components) of the full model. Härdin[11] extends the QSSA approach by considering the higher-order approximation in the computation of the quasi steady-state. In[12], some approaches for reduction of complexity in biochemical reaction networks are considered for use in SYCAMORE, which is a computational research environment in systems biology. One of the approaches considered in[12] is the intrinsic low-dimensional manifold (ILDM) approach, which is an improved time-scale separation technique. More recently[13], a computational singular perturbation (CSP) algorithm was developed to analyze the time-scales of the NF- κ B signaling network which could be used in order to reduce its model. The application of singular perturbation, time-scale separation, quasi equilibrium and quasi steady state approaches to general enzyme-kinetic rate laws, such as Michaelis-Menten and ping-pong bi-bi is difficult and leads to complicated rate law expressions in the reduced models. Some of the time-scale separation techniques are either based on a priori experimental information or eigenvalues of the Jacobian corresponding to the model and hence are only locally effective. Another recent approach for model reduction uses tropical geometry (see e.g.,[14]), wherein the polynomial occuring in every rate equation is replaced by a monomial which is equal to the largest, in absolute value among the monomials that constitute the polynomial.

One of the ways of reducing the complexity of a biochemical model is to reduce the number of parameters in it. This can be done by carrying out a parameter sensitivity analysis (see for e.g.,[15]) and eliminating those parameters whose variations have least effect on the dynamics of a given network. In[8], a time-scale analysis is first done using experimental data to identify the fast and the slow metabolites and this information is then used to carry out an a priori parameter sensitivity analysis to obtain a reduced kinetic model of a biochemical reaction network. In[16], an implicit multiparametric variability analysis (MPVA) method is used to search the entire parameter space in order to determine the set of parameters that can be eliminated. In[17], the authors go one step further by identifying a region in the parameter space where some of the parameters are zero-valued, others have readjusted values and where nevertheless the outputs of the original model match those of the reduced model within a certain tolerance. They further show that parameter sensitivity analysis approach for model reduction may not be always successful. Another way of reducing the complexity of a biochemical reaction network model is to reduce the number of reactions. In[18–20], optimization techniques are used to determine which reactions can be eliminated from the original model without a substantial alteration of the model behaviour.

The method proposed in[21] simplifies a given chemical reaction network by linearly combining reactions in such a way that the resulting network has lesser number of species. However, the kinetics for the reduced set of reactions are determined by the rate limiting steps in the original network and this requires prior biological knowledge of the network. Danø et al.[22] propose reduction by identification and elimination of variables in such a way that the basic dynamic properties of the original model are preserved. In[23], model reduction is achieved by simplifying the rate equations of individual enzymes in the network. A limitation of this method is that it yields a reduced model that predicts measurement data only under specific experimental conditions.

In this paper, we describe a new model reduction method that reduces the number of reactions, metabolites and parameters, such that the dynamics of the metabolite concentrations of the reduced model are close to those of the original model. This method proceeds by a simple stepwise reduction in the number of ‘complexes’, which are defined as the left and right-hand sides of the reactions in the network. The effect of this stepwise reduction is monitored by an error integral, which quantifies how much the behaviour of the reduced model deviates from the original. The method is based on the reduction of the underlying weighted Laplacian (see[24] for a definition) describing the graph structure of the complexes and reactions in the chemical reaction network. A similar technique is also employed in the Kron reduction method for reduction of resistive electrical network models[25].

Our model reduction technique is easy to implement and can be used to reduce reaction networks governed by a vast majority of enzyme kinetic rate laws including Hill kinetics and reversible Michaelis-Menten kinetics. It does not rely on prior knowledge about the dynamic behaviour or biological function of the network. Consequently, it can be automated. Furthermore, the reduced model largely retains the kinetics and structure of the original model. This enables a direct biochemical interpretation and yields insight into which parts of the network have the highest influence on its behaviour. It also accelerates computations and facilitates parameter fitting, especially when we deal with models of huge biochemical reaction networks.

We show the application of our model reduction technique to a yeast glycolysis model[26] and a model of beta-oxidation in rat liver[27]. We have simulated the transient behaviour of the metabolites that are not eliminated during the model reduction procedure. In both the cases, a 30% reduction of the number of variables still retained about 92.5–96.5% agreement between the outputs of the full and the reduced networks.


Organism-level constraints

Organism-level constraints are based on properties that are unique to a specific organism while being consistent for all environmental or experimental conditions. The metabolic network of an organism (determined by DNA sequence) itself can be seen as an organism-level constraint. Organism-level constraints are mostly based on knowledge about physiological limitations and peculiarities of a particular organism or the assumption that the modified organism design is feasible if resources and/or parameters of the existing organism will not be exceeded. No information about experimental conditions is needed to determine values of constraints, as they are applicable for all experimental conditions.

To take into account limited enzyme-building resources, the total enzyme activity constraint [19,20] can be implemented by setting limits for the sum of enzyme concentrations without detailed experiment-specific analysis. This type of constraint is based on assumption that the modified organism should be able to produce as much (or a small fraction more) protein as the initial one. The total enzyme activity constraint is used in several kinetic model studies [15,21–24]. The total enzyme activity constraint is implemented also in stoichiometric models [25,26].

The application of steady-state constraints in both kinetic and stoichiometric models enables the synergy between two model types. Most kinetic models are relatively small but include kinetic parameters and take into account metabolite concentrations. The steady-state fluxes found in kinetic models can be put into stoichiometric models as constraints to test the feasibility of the kinetic model steady-state flux distribution at genome scale where mass and energy balance can be taken into account at a larger scale [27]. The range of metabolite concentrations in kinetic models can be also used to calculate lower and upper constraints of reaction fluxes in stoichiometric models where concentrations cannot be directly applied.

The ability of kinetic models to calculate metabolite concentrations enable the application of metabolite concentration-related constraints. In most cases, these are organism-specific and not related to particular experimental conditions. Each organism may have specific metabolites that are cytotoxic above some concentration that can be used as an upper limit constraint for metabolite concentrations [28]. Similarly, there can be unrealistic or unfeasible upper or lower levels of metabolite concentration prohibited as new steady-state concentrations or even as concentrations during the transition process [29].

Another metabolite concentration-related constraint is the homeostatic one [30,31] used to limit the impact of large changes of internal metabolite concentration in pathway-scale kinetic models to other reactions outside the model's scope via gene expression, reaction flux, reaction directionality, and other potential effects [15,28]. The homeostatic constraint limits optimized steady-state concentrations of metabolites within some range around the steady-state concentrations of the initial model. It can be applied for (1) a pool of internal metabolites [15,21,24,32], (2) each metabolite separately [23,29,33], or (3) a combination of both [22]. Heavy reduction in objective function values by the homeostatic constraint can take place [23]. It might be useful to choose an acceptable concentration range for each metabolite separately taking into account their degree of involvement in other cellular processes outside of the model's scope [23]. A variety of homeostatic constraints is used by Magnus et al. [15] applying metabolite concentration-dependent Gibbs-free energy calculations to assure feasibility of reactions.

A minimal set of adjustable parameters is used as a design constraint, assuming that it reduces the number of unpredictable potential side effects not included in the model [32–34]. It can be applied both for kinetic and stoichiometric models. In case of kinetic models, the comparison of optimization results for a different number of adjustable parameters may be required [35]. The optimization runs for many adjustable parameter combinations and can be done also in an automated way [36].

Application example of organism-level constraints

The impact of the total enzyme activity constraint and the homeostatic constraint looking for minimal set of adjustable parameters (total optimization potential (TOP) approach) is demonstrated in detail [23] (Figure 2), optimizing the model to increase sucrose accumulation in sugarcane culm [37]. The aim is to maximize objective function: proportion of sucrose accumulation in the vacuole relative to sucrose hydrolysis by invertase [23]. The best objective function value for a combination of all five adjustable parameters without constraints was 2.6 × 10 6 (Figure 2B), requesting an unrealistic 1500-fold increase in glucose concentration and a 5-fold increase in enzyme concentrations that are used as adjustable parameters. Introduction of the total enzyme activity constraint did not allow increase in total concentration of enzymes and reduced the objective function value 10-fold to 0.16 × 10 6 (Figure 2B), still relying on an unrealistic 118-fold increase in fructose concentration. Introducing the homeostatic constraint allowing changes of metabolite concentrations just by ±20% reduced the objective function to 4.7 (Figure 1C), demonstrating a dramatic decrease in the objective function value compared with previous cases. Despite that it brings an 34% increase in the objective function value of the original model. Implementation of both the total enzyme activity and homeostatic constraints (Figure 2D) did not reduce further the objective function value of the full set of five adjustable parameters (concentrations of five enzymes) [23]. This illustrates how highly promising but unrealistic designs are made less promising by the value of objective function but are improved in terms of biological viability by implementing additional constraints. The same study demonstrated also application of the TOP approach, revealing that homeostatic and total enzyme activity constraints heavily influence the rank of best adjustable parameter combinations when a minimal set of adjustable parameters is sought (Figure 2). Applying the homeostatic constraint the objective function increase is smaller, but almost all optimization potential can be reached by manipulating values of just two adjustable parameters (Figure 2C and 2D).

Objective function values for the increase in sucrose accumulation in sugarcane culm tissue (maximization of the proportion of sucrose accumulation in the vacuole relative to sucrose hydrolysis by invertase) using up to five enzyme concentrations as adjustable parameters [23]: no constraints applied (A), total enzyme activity constraint applied (B), homeostatic constraint applied (C), total enzyme activity constraint and homeostatic constraint applied (D).

Objective function values for the increase in sucrose accumulation in sugarcane culm tissue (maximization of the proportion of sucrose accumulation in the vacuole relative to sucrose hydrolysis by invertase) using up to five enzyme concentrations as adjustable parameters [23]: no constraints applied (A), total enzyme activity constraint applied (B), homeostatic constraint applied (C), total enzyme activity constraint and homeostatic constraint applied (D).

Metabolite concentration related constraints directly can be applied only in kinetic models while total enzyme activity constraint can be implemented also in stoichiometric models. Despite the fact that the above described organism level constraints are proposed and applied several decades ago, they are also frequently ignored. The calculation of constraints for stoichiometric models using kinetic models has not been applied practically, as far as the authors are aware.


Towards a kinetic model of the Entner-Doudoroff pathway in Zymomonas mobilis

ENGLISH ABSTRACT: Metabolic networks of cellular systems are complex, in that there are numerous components with multiple non-linear interactions. To understand how these networks work they are often split into manageable pieces and studied individually. However, an individual part is unable to account for the complex properties of systems. In order to study these interactions the eld of systems biology has developed. Systems biology makes use of computers to construct models as a method to describe aspects of living systems. Using cellular pathways, kinetic models of metabolic pathways can be constructed and used as a tool to study the biological systems and provide a quantitative description. This thesis describes the quantitative analysis of a bacterium using a systems biology approach. Zymomonas mobilis is a rod shaped, Gram-negative, non-mobile facultative anaerobe and has one of the fastest observed fermentations, yet least energy e cient extractions found in nature. Furthermore it is the only known micro-organism to use the Entner-Doudoro (2-keto-3-deoxy-6- phosphogluconate) pathway anaerobically. The low energy yield of fermentation in Z. mobilis is a result of the usage of the Entner-Doudoro glycolytic pathway, which has half the energy yield per mol substrate compared to the well known Embden-Meyerhof-Parnas glycolytic pathway. The work presented in this thesis forms part of a larger project to compare glycolytic regulation in di erent micro-organisms Z. mobilis, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae and Lactococcus lactis. These organisms were chosen based on their usage of di erent glycolytic mechanisms. Kinetic models are suitable tools to draw a comparison between these organisms. The emphasis here is on the construction of a kinetic model of the Entner-Doudoroff glycolytic pathway as it occurs in Z. mobilis. The aim of this thesis was to characterise as many of the Entner-Doudoro pathway enzymes as possible, under standard conditions. This was done using enzyme assays, to obtain the kinetic parameters of each of the enzymes. Microtitre plate assays were used to characterise most of the enzymes of the Entner-Doudoro pathway. However, not all characterisations could be done using plate assay methods, as some intermediates were not commercially available to perform coupled assays. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy was used to characterise these enzymes. These experimentally obtained parameters were then incorporated in a mathematical framework. Time simulations on the initial model were unable to reach a steady-state, with a build up of metabolic intermediates. A secondary model was constructed (using calculated maximal activities) which allowed us to identify discrepancies in the initial model. This showed that the experimentally determined maximal activities of three enzymes in lower glycolysis were unrealistically low, which might be due to protein denaturation by sonication. A nal model was constructed which incorporated a correction factor for these three enzymes. The models' predicted output (steady-state concentrations and ux) was compared to that of either literature or experimentally determined values, as a method to validate the model. The model output compared well to literature values. The constructed and partially validated kinetic model was then used as an analytical tool to identify points of control and regulation of glycolysis in Z. mobilis. The model presented in this work was also compared to published models. Our model relies much less on literature obtained values, and uses kinetic parameters experimentally determined under the same conditions. The parameters of the published models were obtained from the literature and in many instances, the assay conditions for these parameters were set-up to yield the maximum activity under non-physiological conditions. Furthermore, the number of excluded or assumed parameters is much less in our model. However, introduction of a milder, more predictable extraction technique for preparing cell lysates, should be considered for future work, to obtain the parameters that was not determined during this study. The published models do include reactions not included in our model (e.g ATP metabolism), which should be considered for inclusion, as we strive to construct a detailed kinetic model of glycolysis in Z. mobilis in the future.

AFRIKAANSE OPSOMMING: Sellul^ere metaboliese netwerke is komplekse stelsels, omdat hulle bestaan uit talle komponente met verskeie nie-lineêre interaksies. Om die funksionering van hierdie netwerke te verstaan, word hulle dikwels in hanteerbare stukke verdeel en individueel bestudeer. 'n Enkele komponent is egter nie in staat om die komplekse eienskappe van sulke stelsels te verklaar nie. Die veld van sisteembiologie het ontwikkel met die doel om sulke stelsels te bestudeer. Sisteembiologie maak gebruik van rekenaarmodelle as 'n metode om aspekte van lewende sisteme te beskryf. Kinetiese modelle van metaboliese paaie word gebou en gebruik as gereedskap om die biologiese stelsels te bestudeer en 'n kwantitatiewe beskrywing te bekom. Hierdie tesis beskryf die kwantitatiewe ontleding van 'n bakterie deur middel van 'n sisteembiologiese benadering. Zymomonas Mobilis is 'n staafvormige, Gram-negatiewe, nie-mobiele fakultatiewe ana erobe, en het een van die vinnigste waargenome fermentasies, maar met die minste energie-doeltre ende ekstraksie wat in die natuur aangetref word. Verder is dit die enigste bekende mikro-organisme wat die Entner-Doudoro (2-keto-3-dioksi-6-fosfoglukonaat) pad ana erobies gebruik. Die lae-energieopbrengs van fermentasie in Z. mobilis is 'n gevolg van die gebruik van die Entner-Doudoro metaboliese pad, wat die helfte van die energie-opbrengs per mol substraat lewer, in vergelyking met die bekende Embden-Meyerhof-Parnas pad. Die werk wat in hierdie tesis aangebied word, vorm deel van 'n groter projek om glikolitiese regulering in verskillende mikro-organismes te vergelyk, naamlik Z. mobilis, Escherichia coli, Sac- charomyces en Lactococcus lactis. Hierdie organismes is gekies op grond van hul gebruik van verskillende glikolitiese meganismes. Kinetiese modellering is 'n handige metode om 'n vergelyking tussen hierdie organismes te trek. Hierdie werk fokus op die bou van 'n kinetiese model van die Entner-Doudoro glikolitiese metaboliese pad soos dit in Z. mobilis voorkom. Die doel van hierdie tesis was om so veel moontlik van die Entner-Doudoro ensieme onder standaard-toestande te karakteriseer. Die kinetiese parameters van elk van die ensieme is met behulp van ensimatiese essai's bepaal. Vir die meeste essai's is 96-put mikrotiterplate gebruik, maar nie al die karakteriserings kon met behulp van hierdie metode gedoen word nie, omdat sommige intermediate nie kommersieel beskikbaar was om gekoppelde essai's mee uit te voer nie. Kernmagnetiese resonansie (KMR) spektroskopie is gebruik om hierdie ensieme te karakteriseer. Die eksperimenteel bepaalde parameters is opgeneem in 'n wiskundige raamwerk. Tydsimulasies op die aanvanklike model was nie in staat om 'n bestendige toestand te bereik nie, omdat metaboliete opgebou het. 'n Sekond^ere model is gebou (met behulp van berekende maksimale aktiwiteite) wat ons toegelaat om teenstrydighede in die aanvanklike model te identi seer. Dit het getoon dat die eksperimenteel bepaalde maksimale aktiwiteite van drie ensieme in die laer gedeelte van glikolise te laag was, waarskynlik as gevolg van prote en denaturering tydens die ultrasoniese disintegrasieproses. 'n Finale model is gebou waarin 'n korreksiefaktor vir hierdie drie ensieme opgeneem is. Die modelle se voorspelde uitset (bestendige toestand konsentrasies en uksie) is vergelyk met waardes uit die literatuur of wat ons self bepaal het, as 'n metode om die model te valideer. Die model uitset was in goeie ooreenstemming met hierdie waardes. Die gedeeltelik gevalideerde kinetiese model is voorts gebruik as 'n analitiese instrument om beheer en regulering van glikolise in Z. mobilis te ondersoek. Die model wat in hierdie werk ontwikkel is, is ook vergelyk met die vorige gepubliseerde modelle. Ons model berus baie minder op waardes uit die wetenskaplike literatuur, en maak gebruik van parameters wat eksperimenteel bepaal is, onder identiese toestande. Die parameters van die gepubliseerde modelle is meesal verkry uit die literatuur, en in baie gevalle was die eksperimentele kondisies vir hierdie analises opgestel om die maksimale aktiwiteit te lewer onder nie- siologiese toestande. Verder bevat ons model minder parameters wat of uitgesluit is of wie se waardes aangeneem moes word. In toekomstige werk sal daar egter klem gel^e moet word op 'n minder wisselvallige ekstraksietegniek vir die verkryging van selekstrakte, om sodoende parameters te identi seer wat nie in hierdie werk bepaal kon word nie. Die gepubliseerde modelle sluit ook reaksies in wat nie ingesluit is in ons model nie (bv. ATP metabolisme). Hierdie sou in ag geneem moet word vir insluiting in 'n toekomstige uitgebreide model, om daarna te streef om 'n gedetailleerde kinetiese model van glikolise in Z. mobilis te bou.


Résumé

Kinetic modeling of metabolic pathways has become a major field of systems biology. It combines structural information about metabolic pathways with quantitative enzymatic rate laws. Some of the kinetic constants needed for a model could be collected from ever-growing literature and public web resources, but they are often incomplete, incompatible, or simply not available. We address this lack of information by parameter balancing, a method to complete given sets of kinetic constants. Based on Bayesian parameter estimation, it exploits the thermodynamic dependencies among different biochemical quantities to guess realistic model parameters from available kinetic data. Our algorithm accounts for varying measurement conditions in the input data (pH value and temperature). It can process kinetic constants and state-dependent quantities such as metabolite concentrations or chemical potentials, and uses prior distributions and data augmentation to keep the estimated quantities within plausible ranges. An online service and free software for parameter balancing with models provided in SBML format (Systems Biology Markup Language) is accessible at www.semanticsbml.org. We demonstrate its practical use with a small model of the phosphofructokinase reaction and discuss its possible applications and limitations. In the future, parameter balancing could become an important routine step in the kinetic modeling of large metabolic networks.

SPECIAL ISSUE

This article is part of the B: Robert (Bob) A. Alberty Festschrift special issue.


A comparative analysis of kinetic models of erythrocyte glycolysis.

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Research output : Contribution to Journal › Article › Academic › peer-review

T1 - A comparative analysis of kinetic models of erythrocyte glycolysis.

N2 - Since the 1970s, with Heinrich as a pioneer in the field, numerous kinetic models of erythrocyte glycolysis have been constructed. A functional comparison of eight of these models indicates that the production of ATP and GSH in the red blood cell is largely controlled by the demand reactions. The rate characteristics for the supply and demand blocks indicate a good homeostatic control of ATP and GSH concentrations at different work loads for the pathway, while the production rates of ATP and GSH can be adjusted as needed by the demand reactions. © 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.

AB - Since the 1970s, with Heinrich as a pioneer in the field, numerous kinetic models of erythrocyte glycolysis have been constructed. A functional comparison of eight of these models indicates that the production of ATP and GSH in the red blood cell is largely controlled by the demand reactions. The rate characteristics for the supply and demand blocks indicate a good homeostatic control of ATP and GSH concentrations at different work loads for the pathway, while the production rates of ATP and GSH can be adjusted as needed by the demand reactions. © 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.


Voir la vidéo: biochimie métabolique: Résumé de la glycolyse شرح بالدرجة (Juin 2022).


Commentaires:

  1. Mayer

    Exactement! Je pense que c'est la bonne idée.

  2. Houdain

    C'est miraculeux!

  3. Callough

    On le voit, pas la destination.

  4. Hartmann

    I think you have misled.

  5. Moogusar

    Excusez-moi pour ce que je suis conscient d'interférer ... cette situation. Nous devons discuter. Écrivez ici ou en MP.

  6. Oskari

    Je pense que tu as tort. Je suis sûr. Envoyez-moi un courriel à PM.



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