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Qu'est-ce qu'un plasmide suicide ?

Qu'est-ce qu'un plasmide suicide ?


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Qu'est-ce qu'un plasmide suicide ?

Exemple : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2737453/ mentionne un « vecteur suicide ». Voir aussi http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics/topics/plasmids/allele-exchange.html qui les mentionne également.


Comme on peut le déduire de Shanks et al. article lié à la question: En biologie moléculaire, "plasmide suicide" est un terme qui fait référence à un plasmide qui est réplication incompétente.*

Les plasmides portent normalement une séquence appelée « origine de réplication »Ou Jequi marque le plasmide pour la réplication par la cellule hôte. Les plasmides qui en manquentOu Jene se reproduira pas pendant la division cellulaire et se diluera et/ou se dégradera après quelques générations. D'où le nom : Le plasmide "se suicidera" en devenant rapidement éliminé de la population de molécules d'ADN à l'intérieur de chaque cellule.

Notez que parce que tousOu Jes sont universels, le même plasmide exact peut être un vecteur normal chez une espèce (par exemple E. coli) et un vecteur suicide chez une autre espèce (par exemple P. aeruginosa) - ce qui est logique : si un vecteur ne peut pas se répliquer dans aucune espèce, comment produisez-vous ce vecteur en premier lieu ? (il y a des moyens, mais ils sont laborieux)


* : Je ne parviens pas à trouver une source faisant autorité pour cette définition. Les deux autres paragraphes sont de notoriété publique.


Nouveau vecteur suicide pour le remplacement de gènes chez les yersiniae et d'autres bactéries gram-négatives

Un vecteur suicide nommé pUK4134 a été construit pour élargir le répertoire de vecteurs disponibles pour l'échange allélique de séquences mutées dans les bactéries gram-négatives. Ce plasmide combine les propriétés de deux vecteurs plasmidiques précédemment décrits, pJM703.1 et pRTP1. pUK4134 est un vecteur suicide, portant l'origine de réplication du plasmide R6K et nécessitant ainsi le produit du gène pir pour son maintien stable. Le gène rpsL codant pour la protéine ribosomique d'Escherichia coli S12 confère une sensibilité à la streptomycine aux souches résistantes à la streptomycine et fournit une sélection positive pour les bactéries qui ont perdu le plasmide suite à un échange allélique. Le gène bla permet la sélection par Ap(r). Les autres caractéristiques sont un site de clonage EcoRV unique, l'oriT du plasmide RK2 et la séquence cos du bactériophage . Ce vecteur a été utilisé avec succès à plusieurs reprises pour effectuer des échanges alléliques chez Yersinia pestis.


L'article « Facteurs à prendre en compte dans la conduite de la purification du plasmide » est un excellent exemple d'un article sur la biologie. La purification des plasmides est un domaine de la microbiologie et implique certains principes qui, dans la plupart des cas, sont effectués en laboratoire. Dans ce cas particulier, ce qui est intéressant, c'est la purification de l'ADN. Il existe différentes manières de purifier l'ADN et la purification de plasmides en est un exemple. Dans la plupart des cas, ce qui se passe lors de la purification du plasmide, c'est que certains kits sont impliqués dans le processus.

Ces kits sont ce qui aidera un individu à isoler l'ADN plasmidique sur la base de l'échelle et de la pureté nécessaires. (Horak, 1998) À cet égard, certains éléments doivent être pris en considération lors de la purification des plasmides. Dans ce cas, il sera essentiel de considérer certaines des choses qui sont importantes lors de la réalisation de ce processus. Possession d'un numéro de plasmide Ceci détermine le volume de culture qui sera utilisé dans le processus de purification.

Encore une fois à cet égard, il convient de noter que la manipulation de certaines des propriétés de ces modèles de plasmides peut influencer le résultat final. Ces propriétés incluent la taille, l'origine de réplication entre autres. Ceux-ci influenceront le résultat en termes de qualité et de rendement en ADN. Le nombre attaché à celui-ci influencera la capacité de liaison, par exemple QUIGEN-tip 100 et QUIGEN-tip 500. La nature de la bactérie hôte La souche de la bactérie utilisée influencera grandement la qualité et la quantité.

On a vu que lorsque de grandes quantités de glucides ont été libérées, la qualité de l'ADN libéré sera comparativement inférieure. Dans le même temps, des niveaux élevés d'endonucléase pendant la lyse entraîneront une mauvaise qualité de l'ADN. Ceux-ci sont exposés dans les séries HB101 et JM100 entre autres. Le contexte des bactéries choisies Il devrait y avoir une sélection ambiotique dans tous les aspects de la croissance. Cela garantit que les cellules ne recevant pas de plasmide ne continuent pas à croître et à prospérer même sous les pressions de l'ambiotique.

La sensibilité de ces ambiotiques aux changements de température est également un autre fait qui doit être pris en compte. Application de la thérapie génique de purification de plasmide Il existe certaines thérapies géniques dont le succès dépend fortement de l'insertion de certains gènes qui s'avèrent thérapeutiques et dans ce cas sans provoquer de mutations, de lésions ou de réponse immunitaire. Une des approches utilisables dans ce cas est celle de l'application de vecteurs plasmidiques. (Lipps, 2008) Modèles de maladies Les connaissances sur les plasmides sont parfois utilisées pour effectuer du génie génétique dans les cellules souches embryonnaires dans le but de créer un modèle de maladie génétique, par exemple celui d'un animal.

Episomes Cette application concerne notamment certaines maladies connues comme le cancer par exemple. Les virus du cancer, dans ce cas, sont maintenus à l'état latent. Ce qui se passe, dans ce cas, c'est que les chromosomes de la cellule hôte restent séparés des épisomes. Création d'antibiotiques Certaines caractéristiques représentées par les plasmides lorsqu'ils interagissent avec les cellules permettent le développement d'antibiotiques. Un exemple de ceci est le taux de réplication des cellules contenant le plasmide par rapport aux cellules filles.

Par exemple, des cellules filles prenant des plasmides ne recevant pas peuvent reprendre la culture. Un exemple de composant, dans ce cas, est l'ampicilline qui apparaît dans certains des antibiotiques couramment utilisés à différentes concentrations. (Ehlert, 1993) Avantages du procédé L'application de la purification de plasmides à la réplication de l'ADN présente certains avantages. 1. Conduit à des avancées dans des domaines tels que le clonage Grâce à une connaissance adéquate de l'ADN et de ses activités associées a conduit à certains développements dans les domaines de la réplication.

Dans le cas du clonage, il peut être plus facile de développer des cellules d'un organisme sans nécessairement passer par le processus naturel. 2. Réduit le temps consacré à la recherche Avec ce type d'informations, le temps consacré à la recherche scientifique est considérablement réduit. Il en est ainsi parce qu'il englobe plusieurs problèmes concernant les cellules et les organismes en même temps. Cela a été particulièrement stimulé par le développement de kits qui ont tendance à utiliser cette technologie, laissant les chercheurs se concentrer sur d'autres domaines de leur recherche. 3. Développement de gènes Dans ce même rapport, il existe des développements de gènes.

Par exemple dans le cas de gènes incompatibles entre eux par exemple relatifs à un donneur et à un receveur peuvent être restructurés de manière à les rendre compatibles entre eux grâce à la technologie actuellement disponible. Il existe encore de nombreuses avancées dans le domaine de l'étude des cellules. Ce qui existe aujourd'hui s'avérera plutôt redondant dans quelques années. Cependant, pour le moment, il sera essentiel de comprendre ce qui est actuellement appliqué et d'essayer de l'utiliser de la meilleure façon possible dans le but de réaliser des développements dans nos vies.


2. Méthodes d'édition du génome chez les procaryotes

Plusieurs méthodes ont été développées pour l'édition du génome des bactéries et sont encore largement utilisées en plus des outils basés sur CRISPR. Ces méthodes, cependant, sont très laborieuses, montrent souvent des efficacités incohérentes et nécessitent une personnalisation poussée pour la programmation par rapport à la conception simple de l'ARNg pour CRISPR. Certains des plus représentatifs sont :

2.1. Plasmides suicides

La première méthode développée était les plasmides “suicide” dans les années 1980 [7]. Les plasmides suicides sont ceux qui peuvent se répliquer dans un organisme, mais pas dans un autre appelé receveur. Ces plasmides contiennent une séquence homologue (avec l'insertion, la délétion ou la mutation dirigée souhaitée) couplée à un marqueur, généralement une cassette de résistance aux antibiotiques, et peuvent héberger une séquence de transposon qui facilite leur insertion dans le génome de la souche receveuse après conjugaison avec le donateur. Comme la réplication du plasmide n'est pas possible dans la souche ou l'espèce receveuse, le traitement antibiotique sélectionnera uniquement les colonies qui subissent une intégration du génome (méthode 𠇌lassical”, figure 2 A). Cependant, cette stratégie a généralement une très faible efficacité et peut avoir un taux élevé de faux positifs, nécessitant souvent deux cycles de sélection avec différents antibiotiques pour obtenir des colonies modifiées [8,9]. Il est encore utilisé dans E. coli, mais en particulier dans d'autres organismes procaryotes où de nouvelles alternatives telles que CRISPR-Cas fonctionnent mal pour les grandes délétions/insertions de gènes, par exemple, Corynebacterium glutamicum [9,10]. De plus, les mutants dirigés générés par cette stratégie ont été utiles pour les études de purification de protéines, par exemple, un cytochrome C-terminal tronqué et soluble dans Rhodobacter sphaeroides [11]. Dans ce cas, les domaines hydrosolubles des sous-unités associées à la membrane des complexes respiratoires sont généralement plus propices que les protéines natives à la cristallisation pour les études structurelles [12].

Méthodes standard pour l'édition du génome chez les bactéries. Plasmides suicides. (UNE) L'approche classique consiste à transformer avec un plasmide non réplicatif (généralement avec un élément de transposon, par exemple, mob), qui abrite une matrice de recombinaison mutée et un marqueur de résistance aux antibiotiques (ABr). Le traitement antibiotique sélectionnera uniquement les colonies qui subissent une recombinaison homologue pour incorporer la séquence plasmidique (y compris le gène mutant) au locus cible (gène X perturbateur). (B) Dans la variante “scarless”, un site Scel est incorporé dans le plasmide à transformer dans une souche exprimant I-Scel sous un promoteur inductible (pTet). Après un premier cycle de traitement antibiotique, les colonies cointégrantes hébergeant la séquence plasmidique et l'allèle de type sauvage au locus du gène cible sont sélectionnées. L'ajout de chlortétracycline (CTc) induit l'expression I-Scel pour cliver le locus cible, ce qui améliore la recombinaison homologue pour éliminer la séquence plasmidique entraînant soit une réversion vers le type sauvage, soit la fixation de l'allèle mutant. (C) Recombinaison (système rouge lambda) pour une perturbation ciblée des gènes. Une construction de ciblage avec 50 nt de séquence homologue aux extrémités 5'x02032 et 3'x02032 et un marqueur de résistance aux antibiotiques est réalisée par PCR. La matrice PCR est électroporée et l'expression des protéines lambda Red est induite (Ex. choc thermique à 42 ଌ). Gam inhibe l'activité de la nucléase RecBCD sur l'ADN linéaire (protégeant la construction de ciblage). Exo génère 3 surplombs dans la matrice linéaire d'ADN, auxquels accède la protéine bet pour faciliter la recombinaison homologue, l'intégration et la rupture du gène cible (gène x). Les colonies éditées sont ensuite sélectionnées par traitement antibiotique. () Méthode ClosTron. Un intron de type II avec une activité de transposon est cloné dans une cassette de résistance aux antibiotiques interrompue dans un plasmide. Après transformation, l'intron, qui a été modifié avec une séquence homologue spécifique, cible le gène d'intérêt (G.O.I) et le perturbe en laissant derrière lui un plasmide avec un marqueur fonctionnel de résistance aux antibiotiques. La sélection antibiotique améliore et simplifie alors l'obtention de colonies mutantes.

I-Scel est une endonucléase à tête chercheuse de Saccharomyces cerevisiae qui cible une séquence asymétrique de 18 pb (TAGGGATAACAGGGTAAT), clivant les deux brins d'ADN pour laisser 3' surplombs avec une longueur de quatre paires de bases, ce qui peut induire une recombinaison homologue [13,14]. Les plasmides suicides peuvent incorporer un site I-Scel entre l'allèle mutant et le marqueur de résistance aux antibiotiques. Le plasmide suicide est transformé en un E. coli souche abritant déjà un plasmide inductible pour l'expression I-Scel. Le plasmide suicide est ensuite intégré dans le génome et les colonies sont sélectionnées par leur résistance aux antibiotiques à la température non permissive pour la réplication du plasmide. L'induction de I-Scel clive le locus du gène cible, qui est ensuite réparé via une recombinaison homologue native médiée par RecA, fournissant des bras d'homologie suffisamment grands (𾔀 pb). Cela peut entraîner soit une réversion vers le chromosome de type sauvage, soit un remplacement d'allèle sans marqueur [15] (méthode “Scarless”, Figure 2 B). Théoriquement, un rapport de 50:50 entre les colonies de type sauvage et les colonies d'allèles mutants est attendu, mais cela dépendra de la nature de la mutation. Les petites mutations non délétères sont préférées aux grandes délétions qui ne peuvent pas être réparées aussi efficacement [16]. Dans ce dernier cas, ainsi que pour les mutations conduisant à un défaut de croissance même petit, un grand nombre de colonies doivent être criblées.

2.2. Système Rouge Lambda

Une autre approche largement utilisée pour l'édition du génome chez les procaryotes est le système lambda Red [17]. Ce système est dérivé du bactériophage lambda et il est également connu sous le nom de “recombineering” (génie génétique induit par la recombinaison) [1]. Lambda Red se compose principalement de trois protéines : α, β et γ. α est une exonucléase (exo), qui digère de manière processive le brin à 5 extrémités d'une extrémité d'ADNdb. β (pari) se lie à l'ADNsb et favorise l'annelage des brins. Enfin, γ (gam) se lie à l'enzyme bactérienne RecBCD (qui dégrade tout ADN linéaire utilisé comme matrice) et inhibe ses activités. Ces protéines induisent un état “hyper-recombinaison” dans E. coli et d'autres bactéries, dans lesquelles des événements de recombinaison entre des espèces d'ADN avec aussi peu que 35� pb de séquence partagée se produisent à haute fréquence [1,17,18]. Le système lui-même est cependant sans sélection et est donc généralement associé à l'insertion de grandes cassettes de résistance aux antibiotiques pour améliorer la récupération des colonies éditées [1] ( Figure 2 C). Dans certains cas, des sites I-Scel sont également inclus dans la construction de ciblage pour procéder à une étape de contre-sélection pour éliminer le marqueur de résistance par recombinaison homologue [19].

2.3. Méthode ClosTron

Pendant des décennies, l'édition du génome dans les clostridies a été entravée par le manque d'outils mutationnels pour les études génomiques fonctionnelles. La méthode ClosTron utilise un intron endogène avec une activité de transposon, un intron bactérien du groupe II, comme outil d'inactivation de gène par insertion [20,21]. Il s'agit d'éléments à large spectre d'hôtes dont la spécificité de cible est déterminée en grande partie par l'homologie entre l'ARN d'intron et l'ADN du site cible. De tels introns peuvent donc être re-ciblés en modifiant la séquence d'un plasmide codant pour l'ARN d'intron. Le système ClosTron utilise un élément dérivé de l'intron à large gamme d'hôtes Ll.LtrB de Lactococcus lactis. La spécificité de la cible d'intron est déterminée par une petite région, il est donc rentable de recibler un intron par sous-clonage d'un petit fragment d'ADN ( Figure 2 D).

En général, les méthodes standard d'édition du génome n'ont toujours pas la simplicité et la programmabilité de CRISPR-Cas, ce qui serait crucial pour des efforts plus complexes que les knock-outs d'un seul gène (par exemple, les criblages à l'échelle du génome).


Matériaux et méthodes

Souches et médias

Tous E. coli les souches utilisées sont des dérivés de MG1655. La série MD a été construite en MG1655 rpsL polA12. Les séries de suppression LD et SD ont été construites en utilisant MG1655 rsh3 (rouge:tet (Δ(recC ptr recB recD)∷Plac-rouge) rpsL hsdR:Ap), qui a été construit en utilisant KM22 ( Murphy, 1998 ). MG1655 rpsL a été utilisé pour combiner les unités de délétion LD. Le milieu antibiotique 3 (Becton Dickinson, USA) a été utilisé pour toutes les expériences, à l'exception de celles impliquant sacB sélection, pour laquelle LB (-N) Suc a été utilisé (bouillon LB avec 10 % de saccharose et sans NaCl). La formule approximative par litre du milieu antibiotique 3 est l'extrait de bœuf 1,5 g, l'extrait de levure 1,5 g, la peptone 5,0 g, le dextrose 1,0 g, le chlorure de sodium 3,5 g, le phosphate dipotassique 3,68 g et le phosphate monopotassique 1,32 g.

Construction des plasmides de complémentation

Des plasmides complémentaires ont été construits in vitro ou in vivo. In vitro, les régions chromosomiques ont été amplifiées par PCR à l'aide d'amorces flanquées de sites de restriction, digérées avec des enzymes de restriction et ligaturées dans des vecteurs mini-F (figure 1 supplémentaire et informations supplémentaires) avec de l'ADN ligase T4. In vivo (Figure supplémentaire 2), les fragments d'ADN à cloner ont été préparés et encadrés de deux fragments d'ADN, « KmN » et « mF », par deux réactions de PCR successives et introduits dans le E. coli tension avec le rouge gène du phage et un vecteur mini-F, mFCm4-2. Les fragments introduits ont été clonés dans le vecteur mini-F par rouge recombinaison, résultant en des plasmides de complémentation résistants à la kanamycine (Km R ) et sensibles au chloramphénicol (Cm S ).

Construction de mutants MD

La série MD a été construite avec le E. coli système de recombinaison homologue utilisant des plasmides apparentés à ColE1 et le polA mutant ( Hashimoto et al, 2005 Kato et Hashimoto, sous presse ). Le vecteur 664BSCK2-4 possède deux marqueurs de sélection positive (Cm R et Km R ), deux marqueurs de sélection négative (rpsL + sensible à la streptomycine (Sm S ) et sacB + ), et des sites de multiclonage flanquant le marqueur Km R. Les deux régions chromosomiques flanquant la région ciblée ont été clonées dans 664BSCK2-4, et le plasmide résultant introduit dans MG1655 rpsL polA12. Un transformant Cm R, dans lequel le plasmide a été intégré par recombinaison homologue entre la région clonée et la même région sur le chromosome, a été sélectionné à 42°C. Après incubation à 30°C, une colonie Sm R Km R Cm S, dans laquelle le plasmide a été excisé par une autre recombinaison homologue entre l'autre région chromosomique clonée et la même région sur le chromosome, a été isolée et les délétions ont été confirmées par PCR.

Construction de mutants SD

Le système SD a été décrit précédemment ( Kato et Hashimoto, sous presse ). En bref, un fragment d'ADN linéaire codant pour le gène Cm R a été généré par PCR en utilisant des amorces oligonucléotidiques avec une région d'homologie de 40 paires de bases avec les régions flanquant la délétion ciblée. La fréquence de recombinaison était faible en utilisant des amorces contenant une région d'homologie de 40 paires de bases, mais s'est améliorée lors de la fixation d'une région d'homologie d'environ 1 kb à chaque extrémité du gène CmR. Des fragments ont été introduits dans le E. coli souche MG1655 rouge par électroporation et les recombinants Cm R ont été isolés. Les délétions ont été confirmées par analyse PCR.

Construction de mutants LD

La série LD a été construite par la « méthode de la cassette CRS » en utilisant le rouge système de recombinaison homologue à médiation génique -phage et fragments d'ADN linéaires ( Hashimoto et al, 2005 Kato et Hashimoto, sous presse ). La cassette CRS fait environ 5 kb et porte un marqueur de sélection positive, Cm R , et deux marqueurs de sélection négative, rpsL + (Sm S ) et sacB + . Un fragment d'ADN dans lequel les régions chromosomiques flanquant la région à supprimer ont été jointes aux extrémités de la cassette CRS a été introduit dans MG1655 rsh3. Les colonies Cm R ont été sélectionnées et les délétions confirmées par PCR. Pour retirer la cassette CRS, un fragment d'ADN dans lequel les mêmes régions chromosomiques flanquantes étaient directement jointes les unes aux autres a été introduit dans des colonies Cm R. Les colonies Sm R et résistantes au saccharose ont été sélectionnées et les délétions confirmées par PCR.

Construction mutante FLP-FRT

Le système FLP-FRT2 est illustré à la figure 1 (pour plus de détails, voir Kato et Hashimoto, sous presse). Dans notre système prototype FLP-FRT 1, des fragments d'ADN A-Km et B-Km, qui contiennent le gène Km R lié à deux régions chromosomiques (A et B) flanquant la région à supprimer, ont été préparés par PCR en utilisant 664BSCK2-4 plasmides dérivés utilisés pour construire les délétions MD décrites ci-dessus. Le fragment d'ADN A-Km a été inséré dans un plasmide mini-F, mini-FtsFA (plasmide suicide A avec un marqueur Cm R), qui est défectueux pour la réplication à 42°C, et le fragment d'ADN B-Km a été inséré dans un Plasmide lié à R6K, pSG76SA (plasmide suicide B avec un marqueur Ap R), qui manque pir nécessaire à la réplication ( Posfai et al, 1994 Kato et Hashimoto, sous presse ). Dans un premier temps, pSG76SA portant B-Km a été introduit dans la souche sauvage MG1655 et les recombinants Km R dans lesquels le plasmide a été intégré par recombinaison homologue ont été isolés. Deuxièmement, le plasmide mini-FtsFA portant A-Km a été introduit dans des colonies Km R obtenues comme décrit, et des colonies Cm R ont été obtenues. Troisième, recA a été interrompue par la transduction P1 pour inhiber la recombinaison homologue au-delà de ce stade. Le plasmide contenant le FLP (plasmide de recombinase) a été introduit et l'expression de la recombinase a été induite, entraînant l'excision du plasmide et la délétion du chromosome. Pour obtenir une souche dépourvue du plasmide FLP, les cellules ont été incubées à 35°C, auquel le plasmide FLP ne se réplique pas mais le réplicon miniFts reste fonctionnel.

Le système FRT2 ​​introduit des améliorations au système FRT1 ( Kato et Hashimoto, sous presse ). Brièvement, les deux régions chromosomiques (A et B) flanquant la région ciblée ont été jointes au gène Cm R pour créer A-Cm et B-Cm par PCR. A-Cm a été inséré dans mini-FtsFAK et B-Cm dans pSG76SA. pSG76SA portant B-Cm a été introduit dans la souche de type sauvage MG1655. Des colonies Cm R dans lesquelles le plasmide était intégré ont été isolées. Ensuite, des mini-FtsFAK portant A-Cm ont été introduits dans les recombinants Cm R, et les recombinants résistants à l'ampicilline (Ap R ) ont été isolés à 42°C. Pour inhiber la recombinaison homologue au-delà de ce stade, recA a été perturbé par la transduction P1. Le plasmide FLP a été introduit dans des recombinants Cm R Ap R et l'excision du plasmide et la délétion chromosomique ont été induites. Dans le système FRT3, le plasmide 184 Km pir, encodant une copie fonctionnelle de pir, a été co-introduit avec le plasmide FLP, et le plasmide excisé a été maintenu avec le réplicon R6K en plus du réplicon miniF ts (Kato et Hashimoto, sous presse). Dans tous les autres aspects, le système FRT3 était le même que le système FRT2.


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Méthodes en biologie moléculaire. Vol. 542 2009. p. 261-283 (Methods in Molecular Biology Vol. 542).

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T1 - Thérapie génique suicide à la saporine

AU - Fabbrini, Maria Serena

N2 - Les nouveaux gènes utiles dans la thérapie génique suicide sont ceux codant pour des toxines telles que les protéines végétales inactivant les ribosomes (RIP), qui peuvent bloquer de manière irréversible la synthèse des protéines, provoquant la mort cellulaire par apoptose. Les plasmides exprimant un gène de la saporine cytosolique (SAP) de la saponaire commune (Saponaria officinalis) sont générés en plaçant la région codant pour la toxine végétale mature sous le contrôle de puissants promoteurs viraux et peuvent être placés sous des promoteurs spécifiques de la tumeur. La capacité des constructions résultantes à inhiber la synthèse des protéines est testée dans des cellules tumorales en culture co-transfectées avec un gène rapporteur de luciférase. L'expression de SAP induite par le promoteur du cytomégalovirus (CMV) (pCI-SAP) démontre que seulement 10 ng d'ADN plasmidique par 1,6 × 10 4 cellules de mélanome B16 réduit considérablement l'activité de rapporteur de la luciférase à 18% de celle des cellules témoins (1). Des injections intratumorales directes sont réalisées dans un modèle de mélanome agressif. Les souris porteuses de mélanome B16 injectées avec pCI-SAP complexé avec de la lipofectamine ou du N-(2,3-dioléoyloxy-1-propyl) méthylsulfate de triméthylammonium (DOTAP) montrent une atténuation notable de la croissance tumorale, et cet effet est significativement augmenté par des administrations répétées des complexes d'ADN. Ici, nous décrivons en détail cette approche de gène suicide rentable et sûre.

AB - Les nouveaux gènes utiles dans la thérapie génique suicide sont ceux codant pour des toxines telles que les protéines végétales inactivant les ribosomes (RIP), qui peuvent bloquer de manière irréversible la synthèse des protéines, déclenchant la mort cellulaire par apoptose. Les plasmides exprimant un gène de la saporine cytosolique (SAP) de la saponaire commune (Saponaria officinalis) sont générés en plaçant la région codant pour la toxine végétale mature sous le contrôle de puissants promoteurs viraux et peuvent être placés sous des promoteurs spécifiques de la tumeur. La capacité des constructions résultantes à inhiber la synthèse des protéines est testée dans des cellules tumorales en culture co-transfectées avec un gène rapporteur de luciférase. L'expression de SAP induite par le promoteur du cytomégalovirus (CMV) (pCI-SAP) démontre que seulement 10 ng d'ADN plasmidique par 1,6 × 10 4 cellules de mélanome B16 réduit considérablement l'activité de rapporteur de la luciférase à 18% de celle des cellules témoins (1). Des injections intratumorales directes sont réalisées dans un modèle de mélanome agressif. Les souris porteuses de mélanome B16 injectées avec pCI-SAP complexé avec de la lipofectamine ou du N-(2,3-dioléoyloxy-1-propyl) méthylsulfate de triméthylammonium (DOTAP) montrent une atténuation notable de la croissance tumorale, et cet effet est significativement augmenté par des administrations répétées des complexes d'ADN. Ici, nous décrivons en détail cette approche de gène suicide rentable et sûre.


Un mécanisme général de résistance virale à l'expression du gène suicide

Le bactériophage T7 a été provoqué avec l'un ou l'autre de deux gènes toxiques exprimés à partir de plasmides. Chaque plasmide contenait un gène différent en aval d'un promoteur T7 des cellules hébergeant chaque plasmide a provoqué l'avortement d'une infection par le T7 de type sauvage. T7 a développé une résistance aux deux inhibiteurs en évitant le système d'expression plasmidique plutôt qu'en bloquant ou en contournant les effets du produit génique toxique spécifique. La résistance était due à une combinaison de mutations de l'ARN polymérase T7 et d'autres gènes exprimés en même temps que la polymérase. Les mutations cartographiées sur des sites qui sont peu susceptibles de modifier la spécificité de la polymérase pour son promoteur apparenté, mais la base de la discrimination entre les promoteurs phagiques et plasmidiques in vivo n'a pas été résolue. Un essai de rapporteur a indiqué que, par rapport au phage de type sauvage, l'expression génique du plasmide était diminuée plusieurs fois dans les cellules infectées par les phages évolués. Un phage recombinant, dérivé du mutant d'origine mais dépourvu d'une mutation dans le gène de l'ARN polymérase, a présenté une activité intermédiaire dans le test de rapporteur et une résistance intermédiaire aux cassettes de gènes toxiques. Des altérations à la fois de l'ARN polymérase et d'un second gène sont donc responsables de la résistance. Ces découvertes ont de larges parallèles évolutifs avec d'autres systèmes dans lesquels l'inhibition virale est activée par des signaux de régulation virale tels que des particules interférentes défectueuses, et ils peuvent avoir des parallèles mécanistes avec les phénomènes généraux d'effets de position et de silençage génique.


Transfert conjugal intergénérique à haute efficacité d'ADN plasmidique de Escherichia coli aux streptomycètes limitant l'ADN de méthyle

De nombreux streptomycètes, dont S. coelicolor A3(2), possèdent un puissant système de restriction spécifique au méthyle qui peut constituer une barrière efficace à l'introduction d'ADN hétérologue. Nous avons comparé l'efficacité du transfert conjugal intergénérique de différents types de plasmides à S. coelicolor et S. lividans 66 en utilisant deux E. coli donneurs : la souche standard S17-1, compétente en méthylation. et le donneur déficient en méthylation, ET12567(pUB307). Nous démontrons que le donneur déficient en méthylation peut produire > 10 4 fois plus S. coelicolor exconjugants que le donneur standard. Dans le cas des dérivés de pSET152, qui s'intègrent dans le chromosome hôte par recombinaison spécifique au site, jusqu'à 10 % des spores de streptomycètes dans le mélange de conjugaison héritent du plasmide. La procédure de conjugaison est suffisamment efficace pour obtenir des exconjugants avec des plasmides de délivrance « suicide » et fournit donc une voie simple pour effectuer des perturbations génétiques chez les streptomycètes limitant l'ADN méthyle, et éventuellement d'autres bactéries.


Terminologie de la transfection

La terminologie utilisée pour divers systèmes de délivrance de gènes a évolué pour suivre le rythme des avancées technologiques dans le domaine et s'est affinée pour distinguer diverses méthodes et types de cellules.

Transfection désigne couramment l'introduction d'acides nucléiques dans des cellules eucaryotes, ou plus spécifiquement, dans des cellules animales. Classiquement, le terme transfection était utilisé pour désigner l'absorption d'acide nucléique viral à partir d'un virus ou d'un bactériophage infectant les procaryotes, entraînant une infection et la production de particules virales matures. Cependant, le terme a acquis son sens actuel pour inclure toute introduction artificielle d'acide nucléique étranger dans une cellule.

Transformation est souvent utilisé pour décrire le transfert d'ADN non viral dans les bactéries, les cellules eucaryotes non animales et les cellules végétales. Cependant, la transformation fait également référence à un événement particulier ou à une série d'événements qui entraînent un changement permanent du phénotype d'une cellule animale et implique une instabilité génétique et une progression vers un état cancéreux. Bien que la transformation dans ce sens puisse résulter d'une infection par un virus transformant ou d'une transfection génique, elle peut également survenir spontanément ou à la suite de facteurs de stress externes tels que les rayonnements ionisants ou les mutagènes chimiques. En tant que tel, le terme doit être évité pour les cellules animales lors de la description de l'introduction de matériel génétique exogène.

Transduction est utilisé pour décrire le transfert d'ADN à médiation virale. Cependant, le terme transfection est également utilisé pour désigner l'infection d'une cellule spécifiquement avec un acide nucléique viral qui est isolé soit à partir d'un virus eucaryote, soit à partir d'un bactériophage.


Remerciements

Nous remercions T. Hatch pour la microscopie électronique T. Hirose, C. Engert, D. Denning et A. Corrionero Saiz pour les réactifs C. Engert et J. Meisel pour l'aide avec smFISH N. Ji pour les scripts Matlab que nous avons modifiés pour aider à la notation smFISH data G. Tucker pour l'assistance avec les membres Matlab du laboratoire Horvitz pour l'assistance technique et les discussions et T. Hirose, K. Driscoll et V. Dwivedi pour leurs commentaires sur le manuscrit. Nous remercions D. Hall et WormImage pour l'accès aux micrographies MET (impression JSG #167-278) des travaux de J. Sulston et ses collègues, au MRC/LMB [16]. Ces archives MRC/LMB sont maintenant conservées par le laboratoire Hall à New York avec le soutien du NIH OD 010943.

Le financement

Ce travail a été soutenu par le Howard Hughes Medical Institute. HLJ a été soutenu en partie par la subvention de formation prédoctorale NIH T32GM007287. HRH est professeur de biologie David H. Koch au Massachusetts Institute of Technology et chercheur au Howard Hughes Medical Institute.


Voir la vidéo: Structure du plasmide (Juin 2022).


Commentaires:

  1. Goldwine

    Vous avez frappé la place. Il y a quelque chose à ce sujet, et c'est une bonne idée. Je suis prêt à vous soutenir.

  2. Kelabar

    Quel excellent sujet

  3. Jerod

    Talent, tu ne diras rien.



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