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Pourquoi l'IC50 est-elle une mesure intéressante pour le dépistage in vitro de médicaments anticancéreux ?

Pourquoi l'IC50 est-elle une mesure intéressante pour le dépistage in vitro de médicaments anticancéreux ?


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Des criblages in vitro à grande échelle de médicaments anticancéreux (potentiels) sont effectués pour accéder à leur efficacité en fonction du transcriptome réel d'une lignée cellulaire tumorale. Des bases de données comme GDSC ou CCLE fournissent les données de ces expériences.

Pour chaque expérience médicament-lignée cellulaire, ils fournissent une valeur IC50 : la concentration du médicament nécessaire pour tuer 50 % des cellules cancéreuses in vitro.

Pourquoi cette valeur est-elle intéressante ? La valeur dépend simplement de la toxicité du composé. Dans ces bases de données, le venin de serpent cytotoxique serait probablement considéré comme le meilleur médicament contre le cancer, mais ce ne serait pas une bonne idée de le donner aux patients.

Les médicaments anticancéreux agissent en tuant les cellules cancéreuses plus rapidement que les cellules normales. Par conséquent, je pense que ces valeurs IC50 manquent de normalisation/comparaison à l'IC50 des cellules saines. Sans cela, je pense que les bases de données sont inutiles.

Où ai-je tort ?


ADN et aspects de la biologie moléculaire

7.04.4.3 Hydroxylamine et méthoxylamine

L'hydroxylamine et la méthoxylamine réagissent aux positions C-4 et C-6 des résidus de cytosine exposés dans des conditions de pH neutre et acide pour former deux produits principaux (Schéma 1), en particulier dans les régions simple brin ou les structures non-B-ADN. 40 La visualisation des sites de modification se produit lors de la réaction avec la pipéridine. Il a été démontré que ces composés détectent les jonctions B-Z, 42,170 triplex H, 42,150 et des cytosines mal appariées 132,134 et a été signalé comme étant utile pour le séquençage Maxam-Gilbert de l'ADN dénaturé. 169 Par exemple, l'hydroxylamine a été utilisée pour surveiller l'ouverture d'une épingle à cheveux marquant l'extrémité d'un oligodésoxyribonucléotide conçu pour un ciblage antisens. 171


Nouvelles thérapeutiques dans la découverte et le développement pour le traitement de l'infection chronique par le VHB

4.1 Composés affectant l'assemblage et la maturation de la capside

Plusieurs agents à petites molécules se sont avérés moduler l'assemblage de la capside ou interférer avec l'encapsidation de l'ARNpg du VHB. Baie 41-4109 (5) était un exemple précoce de la série des hétéroaryldihydropyrimidines (HAP), qui sont des effecteurs d'assemblage de capsides qui empêchent la formation de nucléocapsides normales. 32 Le CI50 de la baie 41-4109 contre la réplication du génome du VHB dans les cellules HepG2.2.15 était de 0,05 M, et le CC50 était de 7 M. D'autres études mécanistiques ont révélé que les composés HAP détournaient l'assemblage de la capside à partir de la protéine centrale pour former des produits aberrants. 33

Récemment, GLS-4 (6), qui est structurellement apparenté à la baie 41-4109, a montré une puissance améliorée (IC50 = 0,012 M) et l'indice de sélectivité (SI = CC50/IC50, 6122) dans des cellules hepG2.2.15. 34 Ce composé était également actif contre les mutants du VHB résistants à l'ADV. La capacité de GLS-4 à mal diriger l'assemblage de protéines de base a été étudiée à l'aide de protéines de base tronquées (Cp149), qui pourraient s'assembler spontanément en capsides dans certaines conditions. Le 35 GLS-4 s'est avéré inhiber la réplication du VHB en provoquant le désassemblage de la capside à partir des protéines centrales. Il a également été suggéré que les protéines centrales pourraient jouer plusieurs rôles dans le cycle de vie du VHB, en particulier dans l'encapsidation virale et la régulation de la fonction de l'ADNccc. 36 En tant que telle, cette série de composés offre une approche anti-VHB unique en ciblant les protéines centrales du VHB.

L'ARNpg du VHB est la matrice pour la transcription inverse. L'inhibition de l'encapsidation de l'ARNpg par les protéines centrales peut bloquer la synthèse de l'ADN du VHB, ce qui peut représenter une autre nouvelle approche thérapeutique. Il a été rapporté que les dérivés de phénylpropénamide inhibent la réplication de l'ADN du VHB par ce mécanisme. 37 Dans les cellules HepAD38, AT-130 (7) a démontré une activité anti-VHB (CE50 = 0,13 M, CC50/CE50 > 469). 38 Il a été initialement rapporté que l'AT-130 possédait un E-configuration. Un article récent a clarifié que la majeure partie de l'activité d'inhibition du VHB était en effet dérivée de la Z- les isomères de configuration. 39 Dans le test HepAD38, le composé 8 présentait une activité puissante (CE50 = 0,39 µM) contre la synthèse d'ADN du VHB sans cytotoxicité jusqu'à 10 µM.

Oxymatrine (9), un produit naturel extrait de Sophora japonica, est utilisé depuis des décennies pour traiter les patients atteints d'hépatite B en Chine. L'oxymatrine a inhibé la réplication du VHB en interférant avec le processus de compactage de l'ARNpg dans la nucléocapside et/ou en inhibant la transcription inverse virale via la déstabilisation de l'ARNm de Hsc70. 40,41 études SAR ont identifié des composés 10 et 11 avec une meilleure puissance pour supprimer les niveaux d'ARNm de Hsc70 dans les cellules HepG2.2.15. 42,43 Activité anti-HBV du composé 10, mesurée par l'inhibition de la réplication intracellulaire de l'ADN du VHB, est comparable à celle du LMV. Composé 11 ADN cellulaire réduit du VHB dans les cellules HepG2.2.15 (CE50 = 10 M, SI = 50) et était actif contre les souches de VHB résistantes au LMV dans les cellules Huh-7,5. In vivo évaluation de 11 chez la souris pendant 7 jours n'a pas entraîné d'effets indésirables jusqu'à 750 mg/kg.

Les sulfamoylbenzamides ont récemment été divulgués comme inhibiteurs de l'encapsidation de l'ARNpg. 44 Un composé représentatif (DVR-23, 12) a obtenu une efficacité similaire au LMV (EC50 = 0,39 M, CC50 > 50 M) dans les cellules AML12HBV10. Des études mécanistiques ont révélé que le DVR-23 réduisait de manière dose-dépendante les niveaux d'ARNpg et d'ADN du VHB encapsidés sans affecter la formation de la capside.


Chimiothérapie du cancer

Terminologie et concepts

Les termes liés à l'efficacité et à la toxicité de la chimiothérapie anticancéreuse sont des concepts importants pour comprendre leur activité pharmacologique. Les index thérapeutique pour un agent chimiothérapeutique donné est le rapport entre la dose toxique et la dose thérapeutique pour ce médicament. Pour la plupart des chimiothérapies cytotoxiques utilisées pour traiter le cancer, l'index thérapeutique est un paramètre abstrait car la dose administrée est basée sur la dose maximale tolérée (MTD) plutôt que dose-réponse. Le MTD est une valeur dérivée empiriquement qui représente la dose la plus élevée d'un médicament donné qui peut être administrée en l'absence d'effets secondaires inacceptables ou irréversibles à un échantillon de population limité. Il s'agit d'un concept important dans l'administration de médicaments anticancéreux dans la mesure où les doses de médicaments sont généralement basées sur cette valeur plutôt que sur des évaluations de l'efficacité. Un nouveau concept de médicaments utilisés pour traiter le cancer est le dose biologiquement efficace (BED), basé sur une réponse mesurée à une cible ou un substitut putatif qui est liée au mécanisme d'action de l'agent. La détermination du BED est actuellement plus liée à l'utilisation d'inhibiteurs de transduction de signal et d'agents moléculairement ciblés, cependant, le concept n'est pas exclusif à ces agents et cette approche peut être utile lorsqu'elle est appliquée à la chimiothérapie cytotoxique en utilisant des protocoles de dosage non basés sur la MTD.. Intensité de la dose (DI) est une mesure de dose par unité de temps et permet ainsi des comparaisons entre des schémas posologiques prolongés et compacts. Les comparaisons de l'ID entre, par exemple, un dosage toutes les 3 semaines et toutes les semaines permettent de déterminer si la dose totale du médicament ou de l'ID est liée à la toxicité ou au résultat thérapeutique et l'impact que la modification des schémas posologiques peut avoir sur le résultat. Gain thérapeutique est souvent évalué lors de la combinaison de deux médicaments ou de combinaisons médicament-radiothérapie et décrit quantitativement toute réponse tumorale améliorée par rapport à une toxicité accrue des tissus normaux lorsque les agents sont utilisés dans un calendrier planifié. La base d'un gain thérapeutique positif réside dans les effets tumoraux additifs ou synergiques qui dépassent tous les modèles de toxicité sommative dans les tissus normaux obtenus avec une thérapie combinée.


Matériaux et méthodes

Construction du vecteur plasmidique pET-28a-TAT-LUC

Les amorces ont été conçues sur la base du plasmide contenant la séquence de luciférase de luciole. Des oligonucléotides synthétiques ont été achetés auprès de Genewiz (Suzhou, Chine). Le gène codant pour TAT-LUC a été obtenu auprès de Bluelife Biotechnology (Guangzhou, Chine) qui a été construit en liant le gène TAT avec le gène LUC en utilisant la réaction en chaîne par polymérase (PCR) induite par ligation. TAT-LUC a ensuite été amplifié à l'aide d'une amorce directe (5'-CGCGGATCCATGAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAGAAGACGCCAAAAACATAAA-3' ) contenant un Bamsite H I et l'amorce inverse (5'-CCGCTCGAGCACGGCGATCTTTCCGCCCTTCTTGGC-3') contenant un Xho Je site. La PCR a été réalisée en utilisant KOD plus neo DNA Polymerase (ToYoBo, Shanghai, Chine) avec les paramètres de cycle suivants : température de dénaturation initiale de 94°C pendant 3 min, suivie de 35 cycles de 98°C pendant 15 s, 58°C pour 15 s et 68°C pendant 30 s suivis de 68°C pendant 10 min, conservés à 16°C. Les produits amplifiés par PCR ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose à 1 %. Le produit PCR TAT-LUC a été digéré avec BamH je et Xho I, et le produit a été purifié en utilisant une électrophorèse sur gel d'agarose à 1 %. Il a ensuite été ligaturé à BamH je et Xho J'ai digéré le vecteur pET-28a pour générer la construction recombinante pET-28a-TAT-LUC (figure 1C). Le plasmide recombinant a été transformé en compétent E. coli DH5α et séquencé pour confirmer l'identité des nucléotides. Puis étaler sur une plaque de gélose contenant de la kanamycine (50 g/mL) pour permettre la sélection des colonies qui ont incorporé avec succès les plasmides. L'extraction de l'ADN plasmidique a été réalisée à l'aide du kit d'extraction petit plasmide de haute pureté (Tiangen-Biotech, Pékin, Chine). Les plasmides extraits ont été identifiés par digestion par des enzymes de restriction. Les produits digérés ont été séparés sur un gel d'agarose à 1 % contenant du bromure d'éthidium. Le séquençage des nucléotides a été réalisé à Sangon Biotech (Shanghai, Chine).

Expression de TAT-LUC

La protéine recombinante TAT-LUC a été induite par IPTG et la protéine surexprimée a été isolée et analysée par SDS-PAGE 10 % polyacrylamide. En bref, le vecteur plasmidique pET-28a-TAT-LUC a été transformé en E. coli Des cellules BL21 (DE3) et une seule colonie ont été prélevées sur la plaque de gélose Luria-Bertani (LB) à la kanamycine (50 g/mL) après un jour de culture. Il a été ensemencé dans 5 mL de bouillon LB additionné de 50 g/mL de kanamycine. La culture a été incubée à 37°C avec une agitation continue à 210 tr/min dans un incubateur à agitation pendant une nuit. 5 ml de cette culture primaire ont été inoculés dans 500 ml de culture et incubés à 37°C sous agitation jusqu'à ce que la DO600 atteigne environ 0,5-0,6. Les cellules ont été refroidies à 22°C et de l'IPTG a été ajouté à une concentration finale de 0,5 mM, suivi de 16 h de culture à 22°C. La bactérie a été récoltée par centrifugation (5000 rpm pendant 10 min à 4°C) et les culots cellulaires ont été remis en suspension dans 20 mL de tampon A (20 mM Tris-HCL, pH 8,0, 500 mM NaCl et 10% glycérine). Les cellules bactériennes non induites et induites ont été rompues par sonication, et le surnageant a été collecté par centrifugation (10 000 tr/min pendant 20 min à 4°C). Une culture non induite contenant uniquement le plasmide recombinant a servi de témoin. Les protéines bactériennes entières, le surnageant et le culot ont été analysés par SDS-PAGE à 10 % de polyacrylamide.

Purification de TAT-LUC

Une colonne de résine Ni-NTA (7 sea-biotech, Chine) a été utilisée pour purifier la protéine TAT-LUC. Le surnageant recueilli a été filtré sur membrane 0,45 µM. La colonne d'affinité Ni-NTA a été équilibrée avec 10 volumes de colonne de tampon A, et le filtrat a été appliqué à la colonne de purification. La protéine était naturellement liée à la colonne par gravité et répétée 1 à 2 fois. La colonne a ensuite été lavée avec 10 volumes de tampon A. Vingt volumes de tampon de lavage (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 20 mM d'imidazole, 500 mM de NaCl et 10 % de glycérine) ont été utilisés pour laver la colonne. La protéine cible a été éluée par l'ajout de cinq volumes de tampon d'élution (20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM d'imidazole, 500 mM de NaCl et 10 % de glycérine). L'éluat a été collecté et stocké à 4°C. La procédure de purification a été effectuée à 4°C. L'éluat a été identifié par SDS-PAGE.

La protéine purifiée a été chargée dans un sac de dialyse de poids moléculaire 10 KDa (Thermo Fisher Scientific, America) et dialysée dans un tampon de dialyse (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 5 mM MgCl2 et 10 % de glycérine) pendant une nuit sous agitation magnétique à 4°C. La concentration en protéines après dialyse a été déterminée en utilisant le dosage des protéines à l'acide bicinchoninique (Tiangen-Biotech, Pékin, Chine). L'activité enzymatique de la protéine recombinante a été déterminée en ajoutant de l'ATP, du Mg 2+ et du substrat D-luciférine (sel de sodium, Macklin, Shanghai, Chine).

Culture de cellules tumorales

Des lignées cellulaires tumorales (MDA-MB-231, Huh-7) ont été obtenues auprès des Instituts de biomédecine et de santé de Guangzhou et des lignées cellulaires tumorales résistantes aux médicaments (Skov-3/DDP, A549/DDP) ont été obtenues auprès de l'hôpital provincial du Guangdong de Médecine chinoise. Les cellules ont été cultivées dans du milieu RPMI-1640 additionné de 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine sous 5 % de CO2 à 37°C.

Détermination de l'activité enzymatique TAT-LUC

Pour le dosage de la luciférase acellulaire, une solution de substrat de luciférine a été préparée contenant 50 mg de D-luciférine dans 5 mM de MgCl2 en utilisant de l'eau ultra-pure sans ATP. L'ATP (Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega) a été dilué dans de l'eau sans ATP avec une concentration finale de 10 M, 5 M, 2,5 M, 1,25 M, 625 nM, 313 nM, 156 nM, 78 nM, 39 nM, 20 nM, 10 nM, 0 nM. 1 L de TAT-LUC (3,1 mg/mL) et 1 L de D-luciférine (15 mg/mL) ont été ajoutés à 100 L de différentes concentrations de solution d'ATP. L'activité luciférase a été acquise en utilisant immédiatement un luminomètre à microplaque GloMax® 96 (Promega, Amérique). De plus, la luciférase (LUC) du kit de dosage ATP (Beyotime, Chine) a été utilisée comme contrôle.

Pour le dosage de l'ATP intracellulaire, le meilleur temps d'incubation a été testé dans un premier temps à l'aide d'une étude cinétique. En bref, différents nombres de cellules Skov-3/DDP (0 à 20 000 cellules) ont été cultivés dans des plaques de microtitration à 96 puits à paroi noire (Croning, USA). Le milieu de culture a été remplacé par 100 L de milieu frais sans ATP et TAT-LUC ou LUC a été ajouté pour atteindre une concentration finale de 3,1 mg/mL. Le milieu de culture a été remplacé par du milieu frais contenant de la D-luciférine (150 g/mL) à différentes périodes de temps. La luminescence a été mesurée en utilisant un luminomètre à microplaque GloMax® 96. Le moment optimal pour que TAT-LUC pénètre dans les cellules a été déterminé par une analyse de corrélation du nombre de cellules et de l'intensité de luminescence. De plus, un dosage de luciférase basé sur la lyse cellulaire a été utilisé comme contrôle. Le milieu de culture des cellules adhérentes Skov-3/DDP (0-20000 cellules) dans la plaque de culture a été retiré, et 40 L de solution de lyse cellulaire (kit de test ATP, Beyotime, Chine) ont été ajoutés à chaque puits. Après lyse, le surnageant a été collecté par centrifugation (12000 rpm pendant 5 min à 4°C). Ensuite, le surnageant a été ajouté à une microplaque noire contenant une solution de détection d'ATP, la luminescence a été mesurée immédiatement.

Détection de la chimiosensibilité des cellules tumorales basée sur TAT-LUC

Les cellules tumorales ont été testées pour leur sensibilité au paclitaxel (PTX Aladdin, Shanghai, Chine), au cisplatine (DDP Aladdin, Shanghai, Chine), au carboplatine (CBP Aladdin, Shanghai, Chine), à ​​la gemcitabine (GEM Aladdin, Shanghai, Chine), à ​​la vinorelbine (NVB) Aladdin, Shanghai, Chine), doxorubicine (DOX Takara Biotechnology Co., Ltd., Dalian, Chine), mitomycine (MMC Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd., Jiangsu, Chine), 5-fluorouracile (5-FU Takara Biotechnology Co ., Ltd., Dalian, Chine) et de la vincristine (VCR Aladdin, Shanghai, Chine) en utilisant ce dosage.

Les concentrations de chimiothérapie ont été utilisées à six doses différentes de la concentration plasmatique maximale (PPC, 6,25 %, 12,5 %, 25 %, 50 %, 100 %, 200 %). Les PPC étaient basés sur le dosage clinique ajusté pour donner une bonne discrimination (tableau 1). Trois répétitions parallèles ont été utilisées pour chaque concentration. M0 les puits ont été définis comme témoins sans médicament. La suspension cellulaire a été ajustée à 0,5–1 × 105 cellules/mL et 100 L des suspensions cellulaires ont été ensemencés dans chaque puits d'une microplaque noire à 96 puits. Les plaques ont été incubées dans un incubateur de cellules à 37°C dans un 5% de CO2 pendant 1 à 2 jours. Ensuite, le milieu de culture a été remplacé par le milieu frais sans ATP contenant du TAT-LUC (3,1 mg/mL). Après pénétration de TAT-LUC dans les cellules, le milieu de culture a été remplacé par de la D-luciférine (150 µg/mL) contenant du milieu frais pour analyser la viabilité cellulaire comme décrit ci-dessus.


Viabilité cellulaire et cytotoxicité : 5 tests

Comme les cellules sont retirées de l'environnement vivant (in vivo) et soumises à des manipulations expérimentales dans les systèmes de culture (in vitro), leur viabilité prend de l'importance. La viabilité des cellules représente la capacité de leur existence, de leur survie et de leur développement.

De nombreuses expériences sont réalisées avec des cellules en culture plutôt qu'avec des modèles animaux. C'est notamment le cas en ce qui concerne la détermination de l'innocuité et de la cytotoxicité de plusieurs composés (pharmaceutiques, cosmétiques, anticancéreux, additifs alimentaires). Les tests in vitro pour la cytotoxicité et l'évaluation de l'innocuité sont en fait rentables, en plus de réduire l'utilisation d'animaux.

Les études sur la cytotoxicité impliquent largement les altérations métaboliques des cellules, y compris la mort des cellules en raison des effets toxiques des composés. Par exemple, dans le cas des médicaments anticancéreux, on peut rechercher la mort des cellules, tandis que pour les cosmétiques, les altérations métaboliques et les réponses allergiques peuvent être plus importantes.

Il existe plusieurs tests développés en laboratoire pour mesurer la viabilité cellulaire et la cytotoxicité.

Ils sont généralement classés dans les types suivants :

je. Essais de cytotoxicité et de viabilité.

Je. Tests de cytotoxicité et de viabilité :

La majorité des tests de cytotoxicité et de viabilité sont basés sur la mesure de l'intégrité membranaire, de la respiration cellulaire, de l'incorporation de radio-isotopes, des tests colorimétriques et des tests basés sur la luminescence.

Basé sur l'intégrité de la membrane :

Les mesures les plus courantes de la viabilité cellulaire sont basées sur l'intégrité de la membrane. Les dommages à la membrane peuvent se produire en raison de la désagrégation cellulaire, de la séparation cellulaire ou de la congélation et de la décongélation. L'intégrité membranaire peut être déterminée par l'absorption de colorants auxquels les cellules viables sont imperméables (p.

Les autres tests d'intégrité membranaire sont la libération de chrome marqué (51 Cr), les enzymes et l'utilisation de sondes fluorescentes. Les mesures de viabilité cellulaire, basées sur l'intégrité membranaire, sont immédiates et peuvent être détectées en quelques heures. Cependant, ces mesures ne peuvent pas prédire la survie ultime des cellules.

Le principe de ce dosage repose sur le fait que les cellules viables sont imperméables à plusieurs colorants tels que le noir de naphtalène, le bleu trypan, l'éosine Y, le vert nigrosine et l'érythrocine B. La technique consiste essentiellement à mélanger les cellules en suspension avec le colorant et à examiner eux sous la microscopie. Les cellules colorées et le nombre total de cellules sont comptés. Le pourcentage de cellules non colorées représente les cellules viables.

Le test d'exclusion de colorant est pratique et adapté aux cultures en suspension plutôt qu'aux monocouches. Cela est dû au fait qu'au fur et à mesure que les cellules mortes se détachent des monocouches, elles sont perdues dans le dosage. La principale limitation de ce test est que les cellules mortes sur le plan de la reproduction n'absorbent pas le colorant et seront comptées comme si elles étaient viables.

Les cellules viables peuvent absorber le colorant diacétyl fluorescéine et l'hydrolyser en fluorescéine. Ce dernier est soutenu par les cellules viables, car il est imperméable à la membrane. Les cellules viables émettent donc du vert de fluorescéine alors que les cellules mortes ne le font pas. Ainsi, les cellules viables peuvent être identifiées.

Test d'absorption du chrome marqué :

Le chrome marqué (51 Cr) se lie aux protéines intracellulaires par l'intermédiaire d'acides aminés basiques. Lorsque la membrane cellulaire est endommagée, les protéines marquées s'échappent de la cellule et le degré de fuite est proportionnel à la quantité de dommages. La méthode d'absorption du 51 Cr marqué est utilisée dans les études immunologiques pour déterminer l'activité cytotoxique des lymphocytes T contre les cellules cibles.

Essais de libération d'enzymes :

L'intégrité membranaire des cellules peut également être évaluée en estimant les enzymes libérées. La lactate déshydrogénase (LDH) a été l'enzyme la plus largement utilisée à cette fin.

Basé sur la respiration cellulaire :

La respiration des cellules mesurée par l'utilisation d'oxygène ou la production de dioxyde de carbone peut être utilisée pour évaluer la viabilité des cellules. Cela se fait généralement à l'aide d'un manomètre Warburg.

Basé sur l'incorporation de radio-isotopes :

En utilisant des substrats ou des métabolites radiomarqués, le radiomarqueur dans les produits formés peut être détecté. Cette méthode est particulièrement utile pour les dosages de cytotoxicité de médicaments. Certaines des méthodes importantes d'incorporation de radio-isotopes sont brièvement données.

L'incorporation de (3 H) thymidine dans l'ADN et de (3 H) uridine dans l'ARN sont largement utilisées pour la mesure de la toxicité des médicaments.

Les cellules sont pré-marquées au 32P. Lorsque les dommages surviennent aux cellules, elles libèrent du phosphate marqué qui peut être mesuré. L'efficacité des médicaments peut être évaluée par cette approche.

Basé sur des dosages colorimétriques :

Les développements récents dans les dosages colorimétriques en utilisant des lecteurs de microplaques sophistiqués sont fructueusement utilisés pour la quantification des cellules. On observe une bonne corrélation entre le nombre de cellules et le dosage colorimétrique.

Quelques points saillants de cette approche sont donnés ci-dessous :

je. La teneur en protéines peut être estimée par le bleu de méthylène, le noir amido, la sulforhodamine. Dans la méthode de Lowry pour l'estimation des protéines, le réactif de Folin-Ciocalteau est utilisé.

ii. L'ADN peut être quantifié par coloration avec des colorants fluorescents, par ex. 2-diaminodinophénylindone.

iii. Activité corporelle lysosomale et de Golgi en utilisant du rouge neutre.

iv. Tests d'activité enzymatique, par ex. hexosaminidase, succinate déshydrogénase mitochondriale.

Basé sur un test de luminescence :

La viabilité des cellules peut être mesurée avec une bonne sensibilité en estimant les niveaux d'ATP par un test basé sur la luminescence. Le principe repose sur la réaction suivante.

Une bonne sensibilité de ce test est rapportée pour les cellules dans la gamme de 20 à 2 × 10 7 cellules/ml.

La plupart des médicaments anticancéreux tuent les cellules par apoptose qui peut être mesurée pour l'évaluation de la cytotoxicité. L'apoptose peut être détectée par les moyens suivants.

je. Modifications de la morphologie.

ii. Détection de la phosphatidyl sérine dans la membrane en utilisant l'annexine V conjuguée à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou à la biotine.

Ii. Tests de survie :

Les tests décrits ci-dessus pour la mesure de la viabilité cellulaire et de la cytotoxicité sont à court terme et ils identifient les cellules mortes/vivantes au moment du dosage. Plusieurs fois, lorsque les cellules sont soumises à une toxicité (c'est-à-dire exposées à des médicaments, irradiées), les effets ne sont pas immédiats, mais peuvent être observés après plusieurs heures, voire quelques jours. Les dosages basés sur la survie des cellules (c'est-à-dire la rétention de la capacité de régénération ou de l'intégrité reproductive) sont préférés.

Dans le dosage clonogénique, la survie des cellules est mesurée par l'efficacité d'étalement (c'est-à-dire le pourcentage de cellules ensemencées lors de la sous-culture qui donnent naissance à des colonies). L'efficacité du placage mesure la capacité de prolifération pour plusieurs générations de cellules.

L'essai clonogénique comprend généralement les étapes suivantes :

1. Traitement des cellules avec des concentrations variables d'agent expérimental pendant environ 24 heures.

2. Trypsinisation suivie d'un ensemencement de cellules à faible densité.

3. Incubation des cellules pendant 1 à 3 semaines.

4. Coloration et comptage des colonies.

Une courbe de survie (graphique semi-logarithmique) représentant la fraction de survie des cellules par rapport à la concentration de médicament est représentée sur la figure 38.1. La concentration inhibitrice (CI) fait référence à la concentration de médicament requise pour inhiber la viabilité des cellules. Ainsi, IC50 et CI90 représentent les concentrations d'un composé qui inhibent respectivement 50 % et 90 % de la formation de colonies.

Comme le montre le graphique, la courbe a un genou dans lequel IC50 mensonges, tandis qu'IC90 tombe dans la gamme linéaire. Par conséquent, les différences seront plus importantes dans la plage linéaire.

Le dosage clonogénique est influencé par plusieurs facteurs, les plus importants sont listés :

je. Concentration de l'agent toxique.

iii. Densité cellulaire pendant l'exposition.

iv. Densité cellulaire pendant le clonage.

Test de cytotoxicité basé sur le MTT :

Le sel de tétrazolium 3, (4,5-diméthyl-thiazol-2-yl)-2, 5-diphényl tétrazolium bromure) est communément appelé MTT. C'est un colorant, et est largement utilisé dans les essais de cytotoxicité. Les cellules en croissance dans la phase logarithmique sont exposées à un médicament cytotoxique. Le médicament est ensuite retiré et les cellules sont autorisées à proliférer pendant 2-3 temps de doublement de population (PDT). Le nombre de cellules survivantes peut être détecté par réduction de colorant MTT. La concentration de MTT-formazan formé peut être déterminée par spectrophotométrie.

Le test de cytotoxicité basé sur le MTT est réalisé selon les étapes suivantes :

1. Incubation de cultures monocouches avec différentes concentrations de médicament dans des plaques de microtitration.

2. Retrait du médicament et alimentation des plaques pour réaliser 2-3 PDT.

3. Traitement des plaques au MTT et élimination du milieu et du MTT.

4. Mesure du MTT-formazan dans un lecteur de plaques ELISA.

Lorsque l'absorbance des puits de test/puits de contrôle de la microplaque est tracée en fonction de la concentration du médicament cytotoxique, une courbe sigmoïde est obtenue.

Iii. Analyses métaboliques :

Les dosages métaboliques sont basés sur les mesures des réponses métaboliques des cellules. Ces tests sont effectués après exposition des cellules à des médicaments cytotoxiques (soit immédiatement, soit après 2-3 doublements de population). Les mesures métaboliques les plus couramment utilisées sont la synthèse d'ADN, d'ARN ou de protéines (en estimant leur concentration), outre le dosage de certaines enzymes déshydrogénases.

Limites des tests métaboliques :

L'estimation de la teneur totale en protéine d'ADN peut ou non être indicative d'une augmentation du nombre de cellules. En effet, ces tests ne peuvent pas faire la distinction entre l'activité proliférative et métabolique des cellules. Certains chercheurs préfèrent donc confirmer les mesures métaboliques par un test de survie colonogénique.

Iv. Essais de transformation :

Voici les tests couramment utilisés pour la mesure de la transformation in vitro :

je. Preuve de mutagenèse.

ii. Indépendance de l'ancrage.

iii. Limite de densité réduite de la prolifération cellulaire.

La mutagenèse peut être dosée par échange de chromatides sœurs (SCE). SCE implique essentiellement l'échange réciproque de segments d'ADN entre les chromatides sœurs à des loci identiques dans la phase S du cycle cellulaire. Les échanges de chromatides sœurs sont plus sensibles à la mutagenèse que les cassures chromosomiques. Pour cette raison, les SCE sont préférées dans la recherche de mutagenèse et les essais de transformation. La technique SCE implique essentiellement l'incorporation de nucléotides radioactifs dans la réplication de l'ADN et la détection des SCE par la technique de fluorescence plus Giemsa (FPG).

V. Tests d'inflammation :

Des tests d'inflammation sont nécessaires pour tester les différentes formes d'allergie induites par les produits cosmétiques, pharmaceutiques et autres xénobiotiques. Ces tests sont aux premiers stades de développement dans les cellules en culture.


Matériaux et méthodes

Ensemble de données d'entraînement

Nous avons utilisé les données du projet Genomics of Drug Sensitivity in Cancer [3], qui contient 639 lignées cellulaires cancéreuses, chacune caractérisée par un ensemble de caractéristiques génomiques (détails dans la section suivante). La caractérisation n'est pas complète pour chaque lignée cellulaire, et nous avons donc filtré les lignées cellulaires avec plus de 15 caractéristiques génomiques manquantes, ce qui a réduit l'ensemble des lignées cellulaires sélectionnées de 639 à 608. L'ensemble de données contient 131 médicaments. Comme notre méthode exploite la structure chimique de chaque médicament, ces informations au format SMILES (Simplified Molecular Input Line Entry System) sont nécessaires. Par conséquent, nous n'avons pas pris en compte les 20 médicaments pour lesquels SMILES n'étaient pas disponibles et avons construit notre modèle pour les 111 médicaments restants.

La matrice résultante de 608 lignées cellulaires par 111 médicaments aura 67 488 courbes de réponse médicamenteuse possibles, chacune résumée par son IC50 valeur (concentration du médicament en unités μM nécessaire pour éradiquer 50 % des cellules cancéreuses). Actuellement, l'ensemble de données contient 38 930 IC50 valeurs sur ces 67 488 (58 %), avec des valeurs manquantes principalement dues à des raisons logistiques telles que la coordination des mesures de divers centres de dépistage. La logique50 varie de -7,40 (IC50∼4•10 -8 M la combinaison médicament-cellule la plus sensible) à 6,91 (IC50∼8•10 6 M le plus résistant). Notez que les valeurs extrêmement grandes et petites sont des extrapolations dans le CI50 qui n'ont aucune pertinence clinique. Nous utilisons ces plages dans cette étude car ce sont celles utilisées dans l'article de Garnett et al. [3] avec lesquels nous comparons nos résultats.

Jeu de données de test à l'aveugle

Nous avons généré des ensembles de tests lors de la validation croisée pour estimer l'erreur attendue (détails dans la section validation croisée). Cependant, même la validation croisée peut surestimer les performances potentielles des méthodes d'apprentissage automatique. Par conséquent, nous avons effectué un test véritablement aveugle afin de démontrer les capacités prospectives de nos modèles à validation croisée pour imputer les valeurs IC50 manquantes dans les 608 lignées cellulaires par la matrice de 111 médicaments (Fig S1). Notre test à l'aveugle contient 13 565 IC nouvellement générés50 valeurs, qui ont été obtenues après la formation, ou en d'autres termes, un lot de nouvelles données expérimentales a été généré pour valider indépendamment nos modèles. En résumé, 58% du CI50 les valeurs sont dans l'ensemble de données d'origine (utilisé pour la validation croisée), 18% supplémentaires sont utilisés pour le test à l'aveugle (test indépendant).

Caractéristiques

Il existe deux flux de données d'entrée différents dans notre méthode : le fond génomique de chaque lignée cellulaire cancéreuse et les propriétés chimiques d'un médicament. Pour le premier flux de données d'entrée, les lignées cellulaires cancéreuses sont caractérisées par le statut mutationnel de 77 oncogènes, où chacun d'eux est décrit plus en détail par la variation du nombre de copies (toute amplification de haut grade ou délétion homozygote d'un gène du cancer) et la variation de séquence (changements de la séquence protéique, par exemple le polymorphisme d'un seul nucléotide non synonyme). De plus, il existe une caractéristique binaire pour l'état de stabilité des microsatellites de chaque lignée cellulaire. Les caractéristiques de la lignée cellulaire ont été codées comme suit :

Statut d'instabilité des microsatellites

Toutes mutations considérées, nous avons 77 variations possibles du nombre de copies plus 77 variations de séquences possibles et une valeur de stabilité microsatellite, qui résume jusqu'à 155 caractéristiques de lignées cellulaires possibles. Cependant, quelques caractéristiques mutationnelles sont manquantes pour certaines lignées cellulaires, et nous avons prudemment supprimé une caractéristique au cas où elle serait manquante pour une lignée cellulaire. Cela a conduit à un ensemble final de 138 caractéristiques génomiques caractérisant chaque lignée cellulaire cancéreuse.

Le deuxième flux de données d'entrée incorpore les propriétés chimiques 1D et 2D de chaque médicament. Nous avons généré ces caractéristiques chimiques à l'aide du logiciel PaDEL (v2.11, téléchargé depuis le site Web du projet, http://padel.nus.edu.sg/software/padeldescriptor/) [19] à partir des SMILES avec les paramètres par défaut. 722 caractéristiques sont des descripteurs physico-chimiques et 881 sont obtenues à partir des empreintes digitales, conduisant à un total de 1603 caractéristiques chimiques. Nous n'avons inclus que les caractéristiques chimiques qui pouvaient être calculées pour tous les médicaments. De plus, nous avons supprimé toute caractéristique ayant la même valeur pour tous les médicaments, obtenant un ensemble final de 689 caractéristiques chimiques pour chaque médicament (par exemple, nombre d'atomes, nombre de liaisons, poids moléculaire, empreinte xlogP ou PubChem, pour n'en nommer que quelques-uns). La liste des médicaments est disponible dans le matériel supplémentaire (tableau S1).

En prenant ensemble la lignée cellulaire cancéreuse et le flux de médicaments, nous avons utilisé 827 fonctionnalités pour construire nos modèles prédictifs du log IC50 valeur d'une lignée cellulaire donnée en présence d'un médicament donné.

Validation croisée

Nous avons utilisé une validation croisée en 8 étapes pour construire nos modèles. Par conséquent, nous avons séparé l'ensemble de données d'origine en huit ensembles de CI de taille égale50 valeurs, obtenues en distribuant au hasard tous les IC50s de la matrice en 8 cases. L'un d'eux a été exclusivement utilisé pour les tests (jamais impliqué dans aucun entraînement), les six autres étaient destinés à l'entraînement du modèle et la pièce restante a été utilisée pour l'entraînement croisé. La validation croisée est un processus utilisé pour éviter le sous-apprentissage et le surapprentissage [36], par ex. identifier le nombre optimal d'unités cachées et d'itérations d'entraînement pour un réseau de neurones (détails dans la section « Apprentissage automatique »). Nous avons effectué une rotation itérative des ensembles afin que chaque point de données soit utilisé au moins une fois pour l'entraînement, l'entraînement croisé ou les tests. Enfin, nous avons obtenu 8 modèles, également prédictifs.

De plus, nous avons utilisé une version plus stricte de la validation croisée en 8 étapes décrite ci-dessus. Nous nous sommes assurés que les ensembles de test, de train et de cross-train ne partagent aucune lignée cellulaire, ce qui pourrait se produire dans la version non stricte (décrite ci-dessus). Par exemple, supposons que la lignée cellulaire C1 est traitée avec les médicaments D1, D2 et D3 Pour la validation croisée non stricte, la combinaison C1-D1, C1-D2 et C1-D3 peut être répartie sur test, train et cross-train défini pour la validation croisée stricte, chaque combinaison avec C1 se produit exclusivement dans l'un de ces trois ensembles.

Apprentissage automatique

Pour les réseaux de neurones, nous avons utilisé l'implémentation Java d'Encog 3.0.1 (http://www.heatonresearch.com/encog) [37], [38] d'un perceptron multicouche feed-forward, où nous avons défini trois couches différentes : couche d'entrée, cachée (ou intermédiaire) et de sortie. Chaque perceptron d'une couche est complètement connecté à chaque perceptron de la couche supérieure. Le nombre de caractéristiques déterminait le nombre d'unités d'entrée, ou pour le dire différemment, les perceptrons requis dans la première couche. Le nombre d'unités cachées a été exploré pendant la formation pour déterminer la complexité correcte du modèle, qui se situait entre 1 et 30 unités cachées. De plus, chaque entrée et unité cachée avait également un biais, qui est une entrée d'activation permanente pour ces perceptrons. Nous avons utilisé une seule unité de sortie pour prédire le log continu (IC50) valeur.

Comme fonction d'activation du perceptron pour permettre au réseau de prédire le comportement non linéaire, nous avons utilisé la fonction sigmoïde, qui renvoie des valeurs dans un intervalle de 0 à 1. Par conséquent, nous avons dû normaliser le CI50 valeurs (IC brut50 valeurs, pas dans l'espace du journal) également dans une plage de 0 à 1, ce qui a été fait avec la fonction de type logistique suivante :

: Valeur IC50 observée/attendue, qui doit être un nombre positif supérieur à zéro.

Nous avons entraîné le réseau avec l'implémentation de la rétropropagation d'erreurs résiliente d'Encog avec les paramètres par défaut [39]. Pour explorer la complexité du modèle final, qui est décrite par le nombre d'unités cachées et le nombre d'itérations d'entraînement, nous avons examiné différentes architectures de réseaux de neurones de 1 à 30 unités cachées et les avons entraînées pour un maximum de 400 itérations. Nous avons recherché le minimum global dans ce paysage d'entraînement croisé (en minimisant l'erreur quadratique moyenne de l'ensemble d'entraînement croisé) pour éviter un sous-apprentissage ou un sur-apprentissage (généralement, entre 21 et 27 unités cachées ont été choisies comme meilleur modèle après environ 300 itérations).

Nous avons également réalisé des modèles de régression de forêt aléatoire [40] pour déterminer s'il y avait un gain de performances significatif en utilisant une méthodologie alternative d'apprentissage automatique non paramétrique (Texte S3). Une forêt aléatoire est un ensemble de nombreux arbres de régression différents générés aléatoirement à partir des mêmes données d'apprentissage (la valeur recommandée de n = 500 arbres a été utilisée).

Accès aux données

L'ensemble de données est entièrement accessible du projet Genomics of Drug Sensitivity in Cancer [3], téléchargé à partir du site Web du projet, http://www.cancerrxgene.org/. L'ensemble de formation est basé sur la version v1.0 de juin 2012. IC nouvellement généré50 les valeurs du blind test sont publiées dans la version v1.1 de juillet 2012, qui ne font pas partie de la version v1.0.

Accès au logiciel

L'Encog Machine Learning Framework (version 3.0.1) [37], [38] contenant l'implémentation du réseau de neurones est un logiciel libre disponible et open source (Apache License 2.5), et peut être téléchargé sur la page Web de Heaton Research (http:// www.heatonresearch.com/encog). Pour le modèle de forêt aléatoire, le package R randomForest (version 4.6–6) [41] est également disponible gratuitement sous licence GPL sur la page Web du CRAN (http://cran.r-project.org/web/packages/randomForest/index. html).


Remerciements

Nous remercions toutes les femmes qui ont participé à cette étude. Nous remercions également le professeur Kaye Williams, le professeur Henry Kitchener, le Dr Amy L. Chadwick, le Dr Maria Peires-Pages, le Dr Rosa Sanchez-Alvarez, la biobanque du Centre de recherche biomédicale de l'Université de Manchester, les infrastructures d'imagerie et d'histologie du CRUK-Manchester Institute , le Dr Jason Bruce, le Dr Andrew James, Michael C Jackson, Neil O'Hara, le Seahorse Core Facility de l'Université de Manchester et le Manchester University Hospitals Foundation Trust pour leur soutien et leur aide.


Discussion

L'intérêt croissant pour les vulnérabilités métaboliques du cancer a donné lieu au développement de multiples thérapies ciblées sur le métabolisme ciblant divers aspects du transport et de l'utilisation des nutriments. Par exemple, la synthèse de novo de pyrimidine a été identifiée comme une vulnérabilité métabolique du cancer du sein triple négatif (TNBC), suggérant que l'inhibition de la synthèse de pyrimidine pourrait sensibiliser le TNBC à la chimiothérapie (Brown et al., 2017). Les vulnérabilités métaboliques des cellules cancéreuses peuvent également être exploitées pour lutter contre la résistance aux médicaments. Les cellules cancéreuses résistantes au cisplatine se sont avérées fortement dépendantes de la glutamine pour la biosynthèse des nucléotides et sont donc devenues extrêmement sensibles au traitement avec des antimétabolites qui ciblent le métabolisme des nucléosides (Obrist et al., 2018). Ces résultats mettent en évidence la possibilité d'orienter précisément les thérapies métaboliques vers certains types de cancers grâce à l'identification de leurs vulnérabilités métaboliques.

Le cancer du foie reste l'un des types de cancer les plus difficiles à traiter en raison de la pénurie de médicaments ciblant les dépendances critiques et les inhibiteurs de kinases à large spectre comme le sorafenib et le lenvatinib n'offrent qu'un modeste bénéfice de survie aux patients atteints de CHC (Bray et al., 2018 Lau, 2008). L'exploitation des vulnérabilités métaboliques peut représenter une stratégie prometteuse pour le traitement du cancer du foie. Le cancer du foie a une dépendance métabolique à la glutamine. Il a été rapporté que l'axe HGF-MET inhibe l'activité du complexe pyruvate déshydrogénase (PDHC) mais active le GLS pour faciliter la glutaminolyse dans plusieurs cellules cancéreuses du foie (Huang et al., 2019). Une autre étude a rapporté que la régulation négative de la sirtuine quatre dans le cancer du foie favorisait la tumorigenèse du CHC en améliorant le métabolisme de la glutamine et en régulant les niveaux d'ADP/AMP (Wang et al., 2019). De plus, les tumeurs du foie de souris induites par MYC présentaient une expression accrue de GLS et une expression réduite de glutamate-ammoniac ligase (GLUL) par rapport aux tissus environnants, présentant un catabolisme Gln élevé (Xiang et al., 2015). De manière cohérente, notre étude a montré que la grande majorité des lignées cellulaires de cancer du foie étaient fortement dépendantes de la Gln exogène in vitro, et que la majorité des gènes liés au métabolisme de la Gln étaient régulés à la hausse dans les tissus tumoraux des patients atteints de CHC. Une étude précédente a montré que le ciblage du GLS pourrait atténuer les propriétés de tige du CHC (Li et al., 2019), indiquant l'application possible d'inhibiteurs du GLS dans le CHC. Cependant, le traitement en monothérapie du CB-839 n'a montré qu'un effet anti-tumoral très limité dans la plupart des cellules cancéreuses du foie GD. Des criblages à haut débit, tels que le criblage CRISPR à l'échelle du génome, devraient être appliqués pour découvrir les gènes fonctionnellement importants responsables de la dépendance à la glutamine ou de la sensibilité au CB-839 dans le cancer du foie. L'analyse du métabolome a révélé que le traitement au CB-839 provoquait déjà une forte déplétion de plusieurs métabolites clés impliqués dans le métabolisme du Gln (tels que le GSH), qui ne s'étaient pas rétablis même après 24 heures de traitement médicamenteux, indiquant une possible vulnérabilité métabolique persistante en présence de CB. -839. Cette vulnérabilité métabolique a été encore exacerbée par l'inhibiteur ASCT2 V-9302, en raison d'une nouvelle diminution des niveaux de GSH et d'une augmentation mortelle des niveaux déjà élevés de ROS. Cet effet synergique peut s'expliquer par une double inhibition du métabolisme de la Gln. D'une part, l'inhibition du GLS par le CB-839 empêche la production de glutamate, précurseur direct de la synthèse du GSH, ainsi que l'échange cystine/glutamate par xCT, entraînant une diminution de la cystine, autre précurseur essentiel de la synthèse du GSH. D'autre part, le blocage pharmacologique du principal transporteur de glutamine ASCT2 peut diminuer l'absorption de glutamine extracellulaire, entraînant une pénurie de l'apport de Gln et de la synthèse de GSH (Schulte et al., 2018). Cependant, il y a encore un débat sur la sélectivité de la cible de V-9302 pour ASCT2. Broer et al (Angelika et al., 2018) ont rapporté que le V-9302 n'inhibait pas l'absorption d'ASCT2 et de glutamine, mais bloquait plutôt le transporteur d'acides aminés neutres en sodium 2 (SNAT2) et le grand transporteur d'acides aminés neutres 1 (LAT1). Fait intéressant, il a été rapporté qu'en plus de l'ASCT2, SNAT2 et LAT1 peuvent également médier l'absorption de glutamine dans la plupart des cellules cancéreuses (Bröer et Bröer, 2017). Ainsi, la diminution de l'absorption de glutamine par le V-9302 reste à étudier davantage. De manière impressionnante, nous constatons que la vulnérabilité métabolique induite par le CB-839 peut également être renforcée par plusieurs autres médicaments antimétaboliques tels que l'inhibiteur d'OXPHOS IACS-10759, l'inhibiteur de PPP DHEA et l'inhibiteur de PHGDH NCT503 (Figure 3d). Cette observation suggère la possibilité de développer d'autres nouvelles stratégies de combinaison contre le cancer du foie basées sur le CB-839. Cependant, il convient de noter que notre étude in vitro a été réalisée sur des concentrations physiologiques de glutamine, se produisant à des concentrations qui peuvent ne pas être rencontrées dans les tumeurs solides.

Le foie élimine presque tout l'ammoniac de la veine porte, le convertissant en glutamine et en urée, empêchant ainsi l'entrée dans la circulation systémique. La maladie chronique du foie a une fonction hépatique altérée et conduit généralement à un dysfonctionnement du métabolisme de l'ammoniac. Par exemple, il existe une corrélation générale entre des niveaux plus élevés d'ammoniac et une encéphalopathie plus sévère dans la cirrhose (Olde Damink et al., 2002). En tant qu'enzyme mitochondriale, le GLS joue un rôle important dans le métabolisme hépatique de l'ammoniac (Botman et al., 2014). Il existe deux isoformes distinctes de GLS, GLS1 et GLS2, qui possèdent une distribution tissulaire discrète, des propriétés structurelles et une régulation moléculaire. Les GLS1 gène code pour deux isoformes, la glutaminase de type rein (KGA, isoforme de transcription longue) et la glutaminase C (GAC, isoforme de transcription courte), qui sont exprimées dans les reins et dans une variété d'autres tissus, y compris les cellules cancéreuses (Katt et al., 2017 ). In our study, we found that the GLS1 expression level was significantly increased in HCC tissues. Les GLS2 gene is strongly expressed and active in periportal hepatocytes, where they generate glutamate and release ammonia for urea synthesis (Katt et al., 2017 Curthoys and Watford, 1995). Interestingly enough, CB-839 selectively inhibits GLS1 but not GLS2 (Gross et al., 2014). Taken together, although many HCC patients co-exist liver disease and thus usually have impaired ammonia metabolism, GLS inhibition by CB-839 treatment is less likely to pose a problem for these patients.

The advantage of metabolism-targeted therapies is the ability to non-invasively assess the activity of the metabolic pathway in mouse models and even in the clinic. Recently, a voltage-sensitive, positron emission tomography (PET) radiotracer known as 18 F-BnTP was developed to measure mitochondrial membrane potential in non-small-cell lung cancer. It was found that only mouse tumors with a high uptake of 18 F-BnTP showed marked growth suppression when treated with oxidative-phosphorylation inhibitor IACS-010759 (Momcilovic et al., 2019). Another example is the widespread use of a radioisotope labeled glucose analog, [18F]fluoro-2-deoxyglucose ( 18 F-FDG), in clinical use for diagnosing and staging cancer (Kelloff et al., 2005 Nair et al., 2012). 18 F-FDG undergoes cellular uptake via the same pathway as glucose but becomes trapped intracellularly after phosphorylation by hexokinase, which can be visualized by PET imaging and used to detect glucose uptake in tumors. In our study, we find that the combination of CB-839 and V-9302 only shows synergy in liver tumors that are addicted to Gln. It suggests that measuring Gln uptake or Gln addiction is of potential importance for selecting patients that might benefit from this combination. One way to accomplish this is to test the Gln dependence of tumor cells in vitro, which might be consistent with their metabolic dependence in vivo. A more accurate and practical approach is developing a Gln-based PET imaging agent. The Gln tracers 5- 11 C-(2S)-glutamine ( 11 C-Gln) and 18 F-(2S,4R)4-fluoroglutamine ( 18 F-(2S,4R)4-FGln) provide useful tools for probing and monitoring in vivo metabolism of Gln (Zhu et al., 2017). Tracer 11 C-Gln was shown to visualize glutaminolytic tumors in vivo as a metabolic marker for probing glutamine-addicted tumor (Qu et al., 2012). Similarly, 18 F-(2S,4R)4-FGln PET was reported to track cellular Gln pool size in breast cancers with differential GLS activity and applied as a response marker for CB-839 (Zhou et al., 2017). Therefore, the development of isotope-labeled Gln PET imaging may facilitate the translation of the drug combination strategy described here through the identification of those patients that are most likely to benefit.


Cell Viability with MTT Assay Protocol

Materials for MTT Assay
MTT Solution (5 mg/ml MTT in PBS, pH 7.4, #M2128 Sigma Aldrich)
Solubilization solution, recipe here:

  • 40% v/v Dimethylformamide #D4551 Sigma Aldrich
  • 2% Glacial Acetic Acid #320099 Sigma Aldrich
  • 16% Sodium Dodecyl Sulfate #436143 Sigma Aldrich
  • pH 4.7 & 37 o C

96 well plate
Hep G2 cells
Complete DMEM (indicator-free, no phenol-red) with 10% Fetal Bovine Serum
PBS
Cytotoxic compound (ex: Doxorubicin)



Commentaires:

  1. Cebriones

    vous avez été visité par une excellente pensée

  2. Awarnach

    Oui tout est science-fiction

  3. Yitzchak

    Travailler intelligemment, pas avant la nuit

  4. Denney

    la pensée très précieuse



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