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Les exosomes sont-ils utiles comme mécanisme de transfection ou d'administration dans l'édition de gènes ?

Les exosomes sont-ils utiles comme mécanisme de transfection ou d'administration dans l'édition de gènes ?



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L'utilisation de virus comme agents de transfection ou d'administration pour l'édition de gènes (CRISPR/cas9, etc.) est bien connue. Cependant, un problème avec l'utilisation de virus pour délivrer de l'ADN dans les cellules est la possibilité de déclencher une réponse immunitaire défavorable.

Les cellules utilisent déjà des exosomes pour transporter diverses marchandises à l'intérieur et à l'extérieur des cellules. Cette caractéristique fait-elle des exosomes des candidats idéaux pour fournir également une cargaison d'édition de gènes ?

En outre, existe-t-il des exemples ou des études connus impliquant la réutilisation d'exosomes pour l'édition de gènes ? Spécifiquement pour les applications CRISPER/cas9 ?


Livraison d'ARN et d'ADN à médiation par les exosomes à des cellules résistantes à la transfection

Kits de navette EV
Travailler avec des cellules difficiles à transfecter ? Le kit EV Shuttle tire parti de la capacité naturelle des exosomes à être internalisés et à délivrer des biomolécules fonctionnellement actives telles que des acides nucléiques dans les cellules receveuses. Les exosomes prêts à l'emploi dérivés de cellules rénales embryonnaires humaines (HEK 293) ou de cellules dendritiques murines (JAWS) peuvent être transfectés avec des acides nucléiques, notamment des siARN, des miARN, des ARNm ainsi que de l'ADN plasmidique et ajoutés à une variété transfecter des cellules pour une livraison fonctionnelle améliorée. De plus, cette technologie peut être utilisée pour créer des lignées cellulaires stables qui sont particulièrement utiles pour les cellules réfractaires à la transfection à l'aide du système de transposon piggyBac. Les navettes EV offrent également un avantage significatif par rapport à la méthodologie de transduction basée sur les virus, car elles sont non virales, faciles à manipuler et rentables pour fournir de l'ARN et de l'ADN aux cellules cibles.

Protocole de chargement de navette d'exosomes facile

Les kits de navette EV contiennent un nouvel agent de transfert d'acide nucléique (Exo-Fect) qui permet la transfection d'acides nucléiques directement dans des exosomes isolés. Le si/miARN transfecté, l'ARNm et même l'ADN plasmidique peuvent ensuite être transférés dans les cellules cibles via les vésicules d'exosomes transfectées. Combinez simplement les exosomes isolés fournis dans le kit avec Exo-Fect (cat# EXFT10A-1-SBI) et l'acide nucléique de votre choix pour générer des véhicules d'administration d'exosomes. Les kits sont livrés avec tous les réactifs dont vous avez besoin pour charger les acides nucléiques dans les exosomes et les concentrer pour les administrer aux cellules cibles. Le protocole prend moins d'une heure et est très efficace pour charger les acides nucléiques dans les exosomes pour le transport et la livraison.

Données de livraison de VE
Les navettes EV de souris et d'humain délivrent efficacement des siARN aux cellules difficiles à transfecter. Des exosomes de cellules dendritiques de souris JAWS II ont été Exo-Fected avec 100 pmol d'ARNsi conjugué Texas-Red (témoin non ciblé inclus dans les kits). Les navettes EV chargées de siRNA ont ensuite été ajoutées à des cellules de macrophages de monocytes de souris naïves (RAWS 264.7) en culture. Les cellules ont été imagées après 18 heures et la livraison a été observée dès 4 heures après l'ajout des navettes EV. Plus de 80 % des cellules RAWS 264.7 réceptrices ont internalisé la cargaison d'ARNsi de la navette EV (panneaux de gauche en bas à gauche). Des navettes HEK 293 EV humaines ont été traitées avec le kit Exo-Green de SBI (cat# EXOG200A-1-SBI) qui marque les protéines internes des exosomes de manière verte par fluorescence. Les navettes EV humaines marquées ont ensuite été ajoutées à des cellules souches embryonnaires de souris et imagées pour la livraison de la cargaison après 18 heures. Les navettes EV humaines ont été bien tolérées et les EV ont été absorbés efficacement par les cellules souches embryonnaires de souris (en bas à gauche, à droite).


Comment les navettes EV se comparent-elles à la transfection Lipfectamine® ?
Les protocoles de transfection standard de Lipofectamine® 2000 ont également été comparés à des navettes EV humaines sur des cellules RAWS 264.7 en utilisant exactement la même quantité de siRNA marqué Texas-Red (100 pmol, voir les données de comparaison ci-dessous). Les navettes EV sont plus efficaces pour transfecter des siARN dans des cellules résistantes à la transfection en culture.


Livraison d'ARNsi fonctionnel EV
Les navettes EV humaines peuvent détruire les gènes de la souris. Des navettes HEK 293 EV humaines ont été chargées soit avec un ARNsi anti-CD81, soit avec un ARNsi non ciblé (NT), puis ajoutées à des cellules RAWS 264.7 de souris. Les lysats cellulaires ont été collectés après 18 heures pour une analyse par transfert Western de l'inactivation de la protéine CD81. A gauche, les navettes Human EV transportant l'ARNsi anti-CD81 ont été capables de réduire d'au moins 50 % l'expression des niveaux de protéine CD81 de la cellule cible par rapport au contrôle d'ARNi non ciblé (NT). Les données de l'image occidentale ont été quantifiées et représentées graphiquement dans le panneau adjacent à droite.

Créez des lignées cellulaires stables à l'aide des navettes EV et du piggyBac
Le transposon piggyBac (PB) est un élément génétique mobile qui se transpose efficacement entre les vecteurs et les chromosomes via un mécanisme de "couper-coller". Pendant la transposition, la transposase Super PB reconnaît les séquences répétées inversées terminales (ITR) spécifiques au transposon situées aux deux extrémités du vecteur de transposon et déplace le contenu des sites d'origine et les intègre efficacement dans les sites chromosomiques TTAA.

Le plasmide d'expression de la transposase Super PB (5 ug) et 5 ug des marqueurs codant le vecteur de transposon PB713B-1 PB pour la GFP et un gène de résistance à la puromycine ont été utilisés pour comparer l'efficacité de la transposition à l'aide des méthodes Lipofectamine standard ou des navettes HEK293 EV. Après 72 h après le traitement navette EV, la sélection de puromycine a été initiée à 2 ug/ml puis augmentée à 5 ug/ml pendant 3 jours supplémentaires. Les cellules HEK293 transposées par navette EV ont été imagées après la sélection (panneau supérieur) et comparées à des cellules transfectées par la lipofectamine avec les mêmes plasmides PB (panneau inférieur). La livraison de vecteurs piggyBac par des navettes EV était moins toxique que la transfection, très efficace pour l'intégration du chromosome hôte du transposon PB, et a entraîné environ 5 fois plus de colonies.

Peterson MF, Otoc N, Sethi JK, Gupta A, Antes TJ. Systèmes intégrés pour l'investigation des exosomes. Méthodes. 24 avril 2015. pii : S1046-2023(15)00161-9.

Marcus ME, Leonard JN. FedExosomes : Ingénierie de nanoparticules biologiques thérapeutiques qui offrent vraiment. Pharmaceutique (Bâle). 20136(5) :659-80.

Zomer A, Vendrig T, Hopmans ES, van Eijndhoven M, Middeldorp JM, Pegtel DM. Exosomes : aptes à délivrer un petit ARN. Commun Intégrer Biol. 2010 Sep3(5):447-50.

Pegtel DM, Cosmopoulos K, Thorley-Lawson DA, van Eijndhoven MA, Hopmans ES, Lindenberg JL, de Gruijl TD, Wurdinger T, Middeldorp JM. Livraison fonctionnelle de miARN viraux via les exosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 avril 6107 (14) : 6328-33.

Momen-Heravi F, Bala S, Bukong T, Szabo G. Livraison médiée par l'exosome d'inhibiteur de miARN-155 fonctionnellement actif aux macrophages. Nanomédecine. 29 mars 2014. pii : S1549-9634(14)00132-4.
Liens connexes


Comment les exosomes ont-ils été reconnus pour la première fois en tant qu'entités distinctes ?

La présence de vésicules membraneuses à l'extérieur des cellules a été reconnue pour la première fois il y a 50 ans, bien que celles-ci aient été initialement supposées être des déchets libérés par l'excrétion de la membrane plasmique. La reconnaissance de ce que nous appelons aujourd'hui les exosomes n'est venue qu'en 1983, à partir d'études sur la perte de transferrine lors de la maturation des réticulocytes en érythrocytes [1]. Ces études ont montré, en suivant les conjugués transferrine-or à travers le système endocytaire, que les ILV générés dans les MVB peuvent être libérés dans l'espace extracellulaire par fusion avec la membrane plasmique [2], même si ce n'est qu'en 1987 que le terme « exosome » a été inventé pour eux [3].

Même alors, cependant, ces vésicules extracellulaires étaient largement ignorées, oubliées ou, encore une fois, rejetées comme moyen d'élimination des déchets cellulaires. Ce n'est qu'au cours de la dernière décennie que l'intérêt pour les exosomes a explosé, avec une multiplication par près de dix des publications en autant d'années (115 en 2006, 1010 en 2015).


Matériaux et méthodes

Purification et marquage des exosomes

Des échantillons de sang périphérique humain de patients non atteints de fibrillation auriculaire ont été obtenus au Yonsei University Health System (Séoul, Corée). Le protocole de l'étude était conforme aux principes énoncés dans la Déclaration d'Helsinki et a été approuvé par le comité d'éthique local (YUMC 4-2011-0872). Le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients. Le nom du comité d'éthique est le suivant : Severance Hospital.

Les exosomes ont été purifiés à l'aide du kit de précipitation d'exosomes ExoQuick (SBI System Bioscience, Mountain View, CA, USA), selon les instructions du fabricant. Un volume de 250 L de sérum humain a été mélangé avec 63 L de solution ExoQuick et incubé pendant une nuit à 4°C. Après centrifugation (1500g pendant 30 min), le surnageant a été jeté et les tubes ont été à nouveau centrifugés (1500g pendant 5 minutes). Toutes les traces de liquide ont été aspirées, puis les culots ont été remis en suspension dans 200 L de tampon phosphate salin (PBS) [22].

Après traitement des exosomes dans les cellules, l'absorption des exosomes par les cellules HEK 293 cultivées (cellules rénales humaines) et les cellules H9C2 (cardiomyocytes de rat) a été évaluée à l'aide d'un microscope confocal (LSM710 Carl Zeiss GmbH, Jena, Allemagne). Pour cette évaluation, les exosomes purifiés ont été marqués à l'aide du colorant PKH26 (Sigma, Allemagne) selon les instructions du fabricant, comme décrit précédemment [23]. Brièvement, les exosomes ont été mis en suspension dans 1 mL de diluant C contenant 5 µM de PKH26 et incubés pendant 5 min. L'action de marquage a été arrêtée par incubation pendant 1 min avec un volume égal d'albumine de sérum bovin à 1 % (Bovogen, Melbourne, Australie). Les exosomes ont été lavés deux fois avec un ultrafiltre Amicon (seuil de 10 KDa, Millipore, MA, USA) avec du PBS froid. Par la suite, les exosomes ont été remis en suspension dans 200 L de PBS.

Mélange d'exosomes et de CaCl2

Pour délivrer efficacement des exosomes aux cellules, une méthode modifiée de CaCl2 la transfection a été développée. Les exosomes marqués au PKH26 (50 µg dans du PBS) ont été mélangés avec du CaCl2 solution (0,2 M stock). Le volume final a été ajusté à 150 L en utilisant du PBS stérile. Le mélange a été incubé à 37°C dans un agitateur pendant 10 min à 25 tr/min, puis le tube a été immédiatement placé sur de la glace. Le réactif ExoQuick (30 L) a été ajouté et le mélange a été placé sur de la glace pendant 30 min. L'échantillon a été centrifugé pendant 3 min à 13 000-14 000 tr/min dans une microcentrifugeuse. Le surnageant a été retiré et le culot du mélange a été remis en suspension dans 1 ml de PBS. Le culot a été lavé en utilisant des tubes Amicon Ultra avec du PBS froid. Par la suite, les exosomes ont été remis en suspension dans 200 L de PBS.

Analyse Western blot

L'analyse par Western blot a été réalisée comme nous l'avons décrit précédemment [16]. Brièvement, des culots exosomiques ultracentrifugés ont été lysés avec un tampon de radio-immunoprécipitation (ATTO, NY, USA) contenant un cocktail d'inhibiteur de protéase (ATTO). La quantité totale de protéines a été déterminée à l'aide d'un dosage de protéines à 660 nm (Pierce, MA, USA), et des quantités égales (20 g) de protéines exosomales ont été résolues par électrophorèse sur gel de dodécyl sulfate de sodium-polyacrylamide et transférées sur des membranes de difluorure de polyvinylidène. Les transferts ont été sondés pendant une nuit à 4°C avec anti-Lamp2 (SC-18822 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-CD81 (SC-166029, Santa Cruz Biotechnology), ou anti-Alix (SC-99010 , Santa Cruz Biotechnology), comme indiqué. Les membranes ont ensuite été exposées à des anticorps secondaires anti-souris de souris ou de lapin conjugués à la peroxydase de raifort (Santa Cruz Biotechnology), et les résultats ont été visualisés par chimiluminescence (Advansta, Menlo Park, CA, USA).

La microscopie électronique à transmission

Une grille de microscope électronique revêtue de carbone Formvar a été placée avec le côté formvar vers le bas au-dessus d'une goutte d'exosomes pendant environ 1 min. La grille a été retirée, tamponnée avec du papier filtre et placée sur une goutte d'acétate d'uranyle à 2 % pendant 15 s. L'excès d'acétate d'uranyle a été éliminé et la grille du microscope électronique a été examinée et photographiée pour la microscopie électronique à transmission (MET). Toutes les coupes minces ont été observées au microscope électronique à transmission (JEM-1011 JEOL, Tokyo, Japon) à une tension d'accélération de 80 kV. Les images ont été capturées avec une caméra-Megaview III montée sur le côté (Soft Imaging System, Münster, Allemagne) [24].

Analyse de suivi de nanoparticules

Le nombre de nanoparticules dans les exosomes dérivés du sérum a été évalué à l'aide du système de caractérisation des nanoparticules Nanosight LM10-HS (Nanosight Ltd., Amesbury, Royaume-Uni). Trois enregistrements ont été effectués pour chaque échantillon. Le logiciel Nanosight Tracking Analysis 3.2 a ensuite été utilisé pour analyser la vidéo et pour déterminer la concentration en particules et la distribution granulométrique des particules. Trois vidéos d'une durée de 10 s ont été enregistrées pour chaque échantillon.

Culture de cellules

Les cellules HEK 293 et ​​les cellules H9C2 ont été cultivées comme nous l'avons décrit précédemment [16]. Brièvement, des cellules HEK 293 (Korean Cell Line Bank, Séoul, Corée) et des cellules H9C2 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) ont été maintenues dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (Welgene, Daegu, Corée) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (Young In Frontier, Séoul, Corée) et 1% de pénicilline-streptomycine (Gibco, NY, USA). Les cellules ont été cultivées dans un incubateur humidifié à 37°C avec 5% de CO2.

Immunocytochimie et microscopie confocale

L'immunocytochimie et la microscopie confocale ont été réalisées comme nous l'avons décrit précédemment [16]. Après traitement des cellules HEK 293 et ​​H9C2 avec ou sans exosomes pendant 24 h, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde 4% pendant 60 min à température ambiante et lavées avec du PBS. Les noyaux cellulaires ont été colorés au 4′6‐diamidino‐2‐phénylindole (Santa Cruz Biotechnology). Les images de fluorescence ont été obtenues à l'aide d'un microscope confocal Zeiss LSM710 avec 2 filtres d'excitation (405 et 543 nm). Les données ont été enregistrées sous forme de sections optiques en série, chacune composée de 1024 × 1024 pixels, superposées pour faire la distinction entre les canaux d'émission séparés, et enregistrées sous forme de fichiers TIFF (format de fichier d'image étiqueté). La quantification a été effectuée à l'aide du programme Image J. L'expression de PKH26 et l'expression de DAPI ont été mesurées respectivement en utilisant la fonction RVB de l'histogramme. La même lame a été moyennée en prenant trois parties différentes, et le nombre d'échantillons était de trois.

Test de prolifération cellulaire

Le potentiel cytotoxique des exosomes a été évalué à l'aide d'un test MTS [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium] (Promega, Madison , WI, États-Unis). Les cellules HEK 293 ont été traitées avec des exosomes en triple dans une plaque à 96 puits. La survie cellulaire a été déterminée à l'aide d'un lecteur de plaque de dosage immuno-enzymatique (Molecular Devices, Menlo Park, CA, USA).

Imagerie souris et NIRF

Des souris mâles C57BL/6 (25 g) ont été achetées chez Orient Bio (Séoul, Corée). Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par l'Institutional Animal Care and Use Committee du Yonsei University College of Medicine (Séoul, Corée) et ont été menées conformément aux directives des National Institutes of Health pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Nous avons injecté 150 µg d'exosomes marqués PKH26 par animal. Après 24 h, le cœur, le foie et la rate de chaque souris ont été récoltés et le système d'imagerie IVIS Spectrum (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) a été utilisé pour capturer des images de fluorescence proche infrarouge (NIRF). Les signaux de fluorescence liés à PKH26 ont été discriminés des signaux d'auto-fluorescence en utilisant le logiciel Living Image (PerkinElmer).

Analyses statistiques

Les analyses des données ont été réalisées avec le test t de Student entre deux groupes. Une valeur p de <0,05 a été considérée comme statistiquement significative. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées avec le progiciel statistique SPSS version 23.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, États-Unis).


Méthodes d'ingénierie pour l'encapsulation d'agents thérapeutiques et de sondes d'imagerie

Les exosomes sont composés d'une structure bicouche membranaire lipidique qui exprime les ligands de surface et les récepteurs des cellules sources 24 . La membrane lipidique de l'exosome entoure et contient un noyau hydrophile 24 . Une compréhension approfondie de la structure des exosomes est utile pour manipuler la fonction et l'emballage de la cargaison des exosomes modifiés. Des agents thérapeutiques sont incorporés dans des exosomes ou des mimétiques d'exosomes en utilisant deux approches principales : (I) l'encapsulation active ou (II) l'encapsulation passive. Ces approches entraînent différentes efficacités de chargement et stabilités des médicaments dans les vésicules exosomales.

Méthodes passives de chargement de cargaison

Ces méthodes sont relativement simples et ne nécessitent pas l'ajout de substances actives dans le système.

Incubation avec exosomes

Les exosomes sont simplement incubés avec des médicaments, et les médicaments diffusent dans les exosomes le long du gradient de concentration. L'efficacité de chargement dépend de l'hydrophobie des molécules de médicament. Les médicaments hydrophobes peuvent interagir avec les couches lipidiques de la membrane vésiculaire 47 . Par exemple, dans une étude, des exosomes dérivés de lymphomes de souris ont été incubés avec de la curcumine dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 22 ° C pendant 5 min avant purification par centrifugation en gradient 47 . Dans une autre étude, Haney et al ont réussi à charger l'enzyme catalase, une protéine tétramère de 250 kDa, dans des exosomes extraits de cellules RAW264.7 en tampon PBS à température ambiante pendant 18 h 44. Le principal inconvénient de cette méthode peut être sa faible capacité de chargement.

Incubation avec des cellules donneuses

Les cellules du donneur sont traitées avec un médicament, et ces cellules sécrètent ensuite des exosomes chargés du médicament. Pascucci et al ont traité des cellules de stroma mésenchymateux SR4987 avec une faible dose de paclitaxel pendant 24 h, puis ont lavé les cellules et les ont réensemencées dans un nouveau flacon avec du milieu frais 48 . Après 48 h de culture, le milieu conditionné cellulaire a été collecté et les exosomes ont été isolés. Les exosomes chargés de paclitaxel des cellules traitées avaient des activités anti-prolifératives importantes et fortes contre les cellules pancréatiques humaines CFPAC-1 in vitro, par rapport aux exosomes de cellules non traitées. Fait intéressant, les exosomes des cellules SR4987 non traitées ont également montré un certain effet anti-prolifératif, probablement en raison de la présence de certaines protéines ou acides nucléiques dans les exosomes qui peuvent modifier le microenvironnement tumoral 48 .

Méthodes actives de chargement de cargaison

Sonication

Les exosomes des cellules donneuses sont mélangés avec des médicaments ou des protéines et ensuite soniqués à l'aide d'une sonde d'homogénéisation. La force de cisaillement mécanique de la sonde sonicatrice compromet l'intégrité de la membrane des exosomes et permet au médicament de se diffuser dans les exosomes au cours de cette déformation de la membrane. Kim et al ont démontré que la microviscosité de la membrane des exosomes diminue significativement après sonication 49 . Néanmoins, ce processus de déformation membranaire n'affecte pas de manière significative les protéines liées à la membrane ou le contenu lipidique des exosomes. L'intégrité membranaire des exosomes s'est avérée être restaurée en une heure lorsque les exosomes sont incubés à 37 °C 49 . Cependant, dans certains cas, les médicaments ne sont pas seulement encapsulés à l'intérieur des exosomes mais également attachés à la couche externe de la membrane en conséquence, deux phases de libération du médicament sont observées. La première phase de libération en rafale résulte de la libération du médicament attaché à la couche externe des exosomes, et elle est suivie par la libération lente du médicament encapsulé à l'intérieur des vésicules de l'exosome 49 .

Extrusion

Les exosomes des cellules donneuses sont mélangés avec un médicament et le mélange est chargé dans une extrudeuse de lipides à base de seringue avec des membranes poreuses de 100 à 400 nm sous une température contrôlée. Pendant l'extrusion, la membrane de l'exosome est rompue et vigoureusement mélangée avec le médicament. On ne sait toujours pas si la force mécanique sévère utilisée dans cette méthode modifie les propriétés membranaires, telles que le potentiel zêta, et les structures des protéines membranaires. Führmann et al ont rapporté que le chargement d'exosomes extraits de cellules de cancer du sein MDA-MB231 avec de la porphyrine à l'aide de la méthode d'extrusion modifie le potentiel zêta des exosomes d'origine et provoque une cytotoxicité, tandis que les exosomes chargés de porphyrine préparés à l'aide d'autres méthodes ne présentent pas de cytotoxicité significative 50 . Ces observations pourraient avoir résulté du processus d'extrusion intensif (les exosomes ont été extrudés 31 fois) ont transformé la constitution des vésicules 50 . Cependant, la catalase chargée dans les exosomes dérivés des macrophages RAW264.7 à l'aide de 10 extrusions s'est avérée n'avoir aucune cytotoxicité et démontrer une activité neuroprotectrice supérieure à celle des exosomes préparés par des méthodes de congélation/décongélation ou d'incubation simple 44 . Par conséquent, d'autres études détaillées sur cette méthode sont nécessaires.

Cycles de gel et de dégel

Dans cette procédure, les médicaments sont incubés avec des exosomes à température ambiante pendant une durée fixe, puis le mélange est rapidement congelé à -80 ° C ou dans de l'azote liquide et décongelé à température ambiante. Ce processus est répété pendant au moins 3 cycles pour assurer l'encapsulation du médicament 51 . Cependant, la méthode peut induire l'agrégation des exosomes, entraînant ainsi une large distribution de la taille des exosomes chargés de médicament. La capacité de chargement de médicament de la méthode de congélation/décongélation est généralement inférieure à celle des méthodes de sonication ou d'extrusion. Fait intéressant, cette méthode peut être utilisée pour la fusion membranaire entre les exosomes et les liposomes et a été utilisée pour créer des particules mimétiques d'exosomes, comme l'a rapporté Sato. et al 51, qui ont isolé des exosomes de macrophages RAW264.7 et fusionné les exosomes avec plusieurs types de liposomes à base de phospholipides. Les exosomes-liposomes fusionnés ont été caractérisés à l'aide d'un essai de transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) 51, et le nombre de cycles de gel/dégel s'est avéré affecter les rapports de dilution des lipides, entraînant ainsi des changements dans l'intensité de fluorescence.

Électroporation

Cette technique crée de petits pores dans la membrane des exosomes en appliquant un champ électrique aux exosomes en suspension dans une solution conductrice. Le courant électrique perturbe la bicouche phospholipidique des exosomes, entraînant ainsi la formation de pores temporaires. Des médicaments ou des nucléotides peuvent ensuite diffuser à l'intérieur des exosomes via les pores. L'intégrité de la membrane de l'exosome est ensuite récupérée après le processus de chargement du médicament. Cette méthode est largement utilisée pour charger des siARN ou des miARN dans les exosomes, car ces nucléotides sont relativement gros et ne peuvent pas diffuser spontanément dans l'exosome, comme le font les petites molécules hydrophobes. L'électroporation conduit à une charge supérieure de l'ARNsi par rapport à la transfection chimique 52 . Cependant, l'électroporation peut provoquer une agrégation d'ARN et une instabilité des exosomes, entraînant ainsi une faible capacité de charge. Johnsen et al ont rapporté que l'électroporation dans un tampon optimisé tel que le disaccharide de tréhalose peut aider à maintenir l'intégrité structurelle et peut inhiber l'agrégation d'exosomes extraits de cellules souches dérivées de tissus adipeux 53 . L'électroporation améliore non seulement le chargement d'ARN dans les exosomes, mais augmente également le chargement de petites molécules hydrophiles dans les exosomes, par exemple le 5,10,15,20-tétrakis (1-méthyl-4-pyridinio) porphyrine tétra (p-toluènesulfonate) ou TMP, qui est utilisé pour les effets photodynamiques 50 .

Incubation avec perméabilisants membranaires

La saponine est une molécule tensioactive qui peut former des complexes avec le cholestérol dans les membranes cellulaires et générer des pores, entraînant ainsi une augmentation de la perméabilisation membranaire 54 . La saponine améliore la capacité de chargement de la catalase dans les exosomes, par rapport à la méthode d'incubation simple. Bien que la saponine soit un agent tensioactif, elle ne dégrade pas la catalase, dont l'activité est préservée 44 . La saponine peut également aider à charger des molécules hydrophiles dans les exosomes. Une étude a montré que l'incubation d'une petite molécule hydrophile avec de la saponine multiplie par 11 la charge médicamenteuse dans les exosomes par rapport à la charge passive sans saponine 50 . Cependant, il existe des préoccupations concernant l'activité hémolytique in vivo de la saponine lorsque ce composé est utilisé 54 . Par conséquent, la concentration de saponine utilisée pour le chargement du médicament doit être limitée et les exosomes doivent être purifiés après incubation avec de la saponine.

Cliquez sur la méthode de chimie pour la conjugaison directe

Les méthodes chimiques peuvent également être utilisées pour attacher directement des molécules à la surface des exosomes via des liaisons covalentes. La cycloaddition alcyne azoture catalysée par le cuivre, connue sous le nom de chimie click, est idéale pour la bioconjugaison de petites molécules et macromolécules à la surface des exosomes 11 . Un groupe chimique alcyne et un groupe chimique azoture réagissent pour former une liaison triazole. La réaction est rapide et efficace, par rapport aux réactions de réticulation traditionnelles, telles que le couplage maléimide-thiol, et offre un meilleur contrôle du site de conjugaison. Il convient également à la modification de macromolécules biologiques, car il peut se produire dans des milieux aqueux 55 . Forgeron et al ont rapporté qu'un exosome réticulé avec des groupes alcyne en utilisant la chimie du carbodiimide peut être conjugué à un azoture modèle, azoture-fluor 545 56 . Cette conjugaison n'a aucun effet sur la taille et l'internalisation des exosomes, suggérant ainsi que la réaction est douce et n'affecte pas la structure ou la fonction des exosomes.

Anticorps contre les protéines exosomales

Des études récentes ont indiqué que les exosomes portent le contenu génétique et protéomique de leurs cellules mères. Les fluorophores et les microbilles conjugués à des anticorps hautement spécifiques peuvent se lier à un antigène particulier à la surface cellulaire. Higginbotham et al ont démontré la faisabilité de l'utilisation du tri des vésicules activé par fluorescence pour analyser et trier les exosomes individuels isolés des cellules DiFi 57 . L'EGFR et le marqueur exosomal CD9 ont été utilisés pour conjuguer Alexa-647 aux surfaces des exosomes pour la détection. Étant donné que les exosomes portent les antigènes de leurs cellules mères, il est logique de supposer que des microbilles spécifiques conjuguées à un antigène peuvent être utilisées pour l'isolement et le suivi des exosomes. in vivo.

Les différentes approches utilisées pour charger des cargaisons dans des exosomes ont chacune des capacités de chargement différentes, qui dépendent des propriétés de la cargaison telles que l'hydrophilie, l'hydrophobie et le poids moléculaire. Haney et al ont rapporté que la sonication et l'extrusion fournissent la charge de catalase la plus élevée dans les exosomes, par rapport aux cycles de gel/dégel et à l'incubation passive, qui donnent la plus faible efficacité de charge de médicament 44 . Cependant, l'efficacité de chargement n'est pas le seul facteur qui doit être pris en compte. L'intégrité et la stabilité de la membrane des exosomes sont également importantes dans l'administration du médicament. Comme mentionné précédemment, bien que le chargement de catalase dans les exosomes à l'aide de la sonication et de l'extrusion entraîne une bonne activité enzymatique, d'autres études ont montré que l'intégrité de la membrane est compromise et que la structure de la protéine liée à la membrane peut changer, affectant ainsi l'effet thérapeutique des exosomes chargés de médicament. . Par conséquent, une enquête plus approfondie est nécessaire.

Ingénierie des exosomes pour l'administration de molécules thérapeutiques et diagnostiques

Les stratégies décrites précédemment pour l'ingénierie des exosomes mettent en évidence les avantages uniques des nanoplateformes à base d'exosomes pour la livraison de marchandises. Une série de bons exemples de ces stratégies qui ont été appliquées avec succès pour la livraison de molécules fonctionnelles à médiation par les exosomes sont présentés dans le tableau 1.

Livraison de petites molécules thérapeutiques

Plusieurs petites molécules, à la fois hydrophobes et hydrophiles, ont été incorporées dans les exosomes en utilisant les différentes méthodes mentionnées dans la section ci-dessus (Figure 2A, 2B). Dans la plupart des cas, l'administration exosomale entraîne une accumulation plus élevée de médicaments dans les cellules cibles et une amélioration de la stabilité des petites molécules et du temps de circulation sanguine, améliorant ainsi la puissance des médicaments à petites molécules et abaissant la CI50. Munagala et al ont utilisé des exosomes isolés du lait bovin pour encapsuler des agents chimiothérapeutiques et chimiopréventifs, tels que le paclitaxel, la doxorubicine et la withaférine, par chargement passif 58 . Ces médicaments sont libérés lentement des exosomes d'une manière dépendante du temps. Les chercheurs ont démontré que les exosomes chargés en withaférine et les exosomes chargés en paclitaxel ont une CI plus faible50 que ceux des médicaments libres pour les activités anti-prolifératives contre les cellules cancéreuses du poumon A549. Ils ont également confirmé l'efficacité anti-tumorale in vivo en utilisant un modèle de souris porteuses de tumeurs. Les exosomes chargés de withaférine présentent un effet inhibiteur significativement plus important sur les tumeurs par rapport à celui des témoins après injection intrapéritonéale à une dose sous-optimale 58 . soleil et al ont démontré que les exosomes chargés de curcumine isolés de la lignée cellulaire de lymphome de souris EL-4 présentent une meilleure stabilité de la curcumine in vitro et une concentration sanguine plus élevée in vivo 47 . En conséquence, le niveau de curcumine augmente dans les cellules cibles CD11b+Gr-1+ et une suppression significative des cytokines inflammatoires telles que l'IL-6 et le TNF-α a été obtenue dans un modèle de choc septique induit par les lipopolysaccharides chez des souris immunocompétentes. 47 . Kim a rapporté que les exosomes dérivés de macrophages chargés de paclitaxel, par rapport aux liposomes chargés de paclitaxel, augmentent de manière significative l'absorption cellulaire dans la lignée cellulaire de carcinome pulmonaire de Lewis murin 3LL-M227 59 . Il est intéressant de noter que les exosomes chargés de paclitaxel ont permis de surmonter le problème de résistance aux médicaments dans les cellules MDCK MDR1. Le CI50s des exosomes chargés de paclitaxel sont significativement inférieurs à ceux du paclitaxel libre et du Taxol 59 . Ainsi, l'administration d'exosomes peut contourner le système d'efflux de médicament de la glycoprotéine P (P-gp). Cependant, les exosomes eux-mêmes n'inhibent pas la P-gp, et le mécanisme par lequel ils surmontent la résistance aux médicaments reste incertain.

Représentation schématique des différents types de systèmes d'administration de médicaments exosomes. Les exosomes sont constitués d'une bicouche lipidique qui peut être composée de lipides, qui renferme un noyau aqueux. La bicouche lipidique et l'espace aqueux peuvent incorporer des composés hydrophobes (A) ou hydrophiles (B), respectivement. (C) Les exosomes peuvent être utilisés pour l'administration d'ADN, d'ARN et de protéines. (D) Des sondes théranostiques ou d'imagerie, des ligands de ciblage spécifiques et une liaison covalente peuvent être attachés à la surface de l'exosome.

Livraison d'ARN thérapeutique

L'ARN est une grosse molécule et est difficile à délivrer in vivo. Plusieurs approches ont été explorées, telles que l'utilisation de liposomes cationiques 60,61, de dendrimères 62 et de particules à base de polymère cationique 63 . Cependant, ces supports ne sont pas adaptés à une utilisation en pratique clinique, en raison de problèmes de sécurité, de stabilité et hors cible 64 . La technique la plus couramment utilisée pour incorporer des siARN ou des miARN dans les exosomes est l'électroporation, car cette méthode déstabilise la membrane vésiculaire et permet aux siARN ou miARN de pénétrer dans les vésicules. Cependant, l'agrégation des exosomes et de l'ARN pendant l'électroporation a déjà été rapportée, comme discuté ci-dessus. Alvarez-Erviti et al ont utilisé des exosomes dendritiques murins auto-dérivés ciblés avec la protéine Lamp2b pour délivrer le siRNA GADPH et le siRNA BACE1 à travers la barrière hémato-encéphalique chez la souris. Les données montrent que le gène de ménage, le GADPH et les exosomes chargés de BACE1 suppriment fortement l'expression de l'ARNm et de l'-amyloïde dans le cerveau des souris de type sauvage après injection intraveineuse, par rapport à la lipofectamine et à l'ARNsi-RVG-9R65. Wahlgren et al ont démontré que les siARN chargés dans les exosomes isolés du plasma humain ciblent avec succès les monocytes et les lymphocytes et font ensuite taire le gène MAPK1. Les données ont également montré que les exosomes chargés de siRNA se co-localisent dans le cytoplasme des cellules receveuses. Cependant, seulement in vitro des études ont été entreprises, dans lesquelles les exosomes ont été co-cultivés avec les cellules receveuses en conséquence, ces cellules receveuses absorbent les exosomes plus facilement qu'elles ne le feraient dans un in vivo situation 52 . Oh non et al ont rapporté la livraison d'exosomes ciblés GE11 contenant le miARN let-7a à des cellules de cancer du sein surexprimant le facteur de croissance épidermique (EGFR) dans un modèle de xénogreffe de souris. GE11-targeted exosomes show higher tumor accumulation than do controls. Moreover, the exosomes isolated from donor cells previously transfected with let-7a miRNA inhibit tumor growth in mice 66 . These examples suggest that exosomes are a promising method for gene delivery with better safety profiles than those of viral vectors, cationic lipids, or polymer based particles.

Delivery of therapeutic proteins

Utilizing exosomes is one of the most promising methods for delivering macromolecular proteins (Figure 2C). Proteins can be loaded into exosomes through genetic engineering of the donor cells or through direct loaded into the exosomes. In the first method, donor cells are transfected with a plasmid carrying the gene of interest. Consequently, the cells synthesize the protein encoded by the inserted gene, and these proteins are subsequently secreted into the extracellular vesicles. At this stage, the extracellular vesicles can be isolated by collecting the cell culture supernatant and then purified. In the second method, proteins are directly loaded into exosomes as mentioned in the previous section. Catalase, a redox enzyme, loaded in exosomes extracted from macrophages has neuroprotective effects against oxidative stress in mice with acute brain inflammation. Catalase-loaded exosomes significantly decreases microgliosis and astrocytosis in the mouse brain and decreases rotation after apomorphine induction. These data suggest that exosomes are able to preserve catalase function and deliver catalase to the mouse brain after intranasal administration 44 .

Delivery of imaging molecules

Currently, a number of reports demonstrating post-isolation strategies to modify exosome surface structures have described methods to more effectively track exosomes in vitro ou in vivo (Figure 2D). Lai et al have engineered human embryonic kidney 293T exosomes expressing a membrane-bound Gaussian luciferase fused to a biotin receptor domain and then complexed the biotin expressed on the exosomes with fluorescent Alexa Fluor 680-streptavidin 67 , thus allowing the exosomes to be tracked in vivo either by bioluminescence or fluorescence. In addition, Wilna et al have used fluorophore-conjugated antibodies against the exosomal proteins CD24 and aquaporin 2 (AQP2) to identify a subpopulation of CD24- and AQP2-positive exosomes by using nanoparticle tracking analysis (NTA) in vitro 68 . Wang et al have used anti-CD63 antibody-conjugated microbeads and secondary antibody-conjugated Q-dots to track endothelial cell exosomes by using NTA 69 . Exosomes are initially formed during the inward budding of late endosomes and are subsequently stored inside of multi-vesicular bodies (MVBs) before being released into the extracellular space. Thus, it is not surprising that some endosomal forming and sorting proteins (Rab5, Rab27 and Rab35), heat-shock proteins, and tetraspanins (CD9, CD63 and CD81) are enriched in exosomes. Because of this enrichment, and the presence of other donor cell-derived factors within exosomes, the selection of source cells has a great impact on the function and distribution of exosomes and must be considered carefully.


The Lenti-X and Lenti-X Tet-On 3G CRISPR/Cas9 systems are complete systems for lentiviral-mediated CRISPR/Cas9 genome editing.

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Conclusion

The strong prediction of in vivo exosome function from in vitro analyses represents a step toward producing patient‐specific exosome therapeutics. These studies can identify optimal donors and stem cell manipulations predicted to improve exosome function before performing in vivo experiments. Combinations of high‐performing donor cell exosomes or stem cell manipulations can produce maximally functional exosome therapies. Further studies may use exosome miRNA data in combination with patient characteristics to predict clinical outcomes in patients. Although our approach does not identify causative mechanisms, the unbiased and quantitative selection of cues and signals allows for improved understanding of CPC exosome effects and has the potential to be extended to predict exosome function for similar outcomes in other diseases.


Exo Ldlr treatment reduces liver steatosis and atherosclerosis in Ldlr -/- mice

We systemically analyzed the therapeutic effects of Exo Ldlr . Les Ldlr -/- mice were fed with a high-fat diet for 8 weeks, followed by an injection of indicated exosomes once a week for 8 weeks (Figure 5A). Oil Red O staining of liver sections showed that Exo Ldlr treatment significantly reduced the accumulation of lipid droplets in the hepatocytes (Figure 5B-C). Plasma AST and ALT activities were much lower in Exo Ldlr treated mice (Figure 5D-E). Moreover, the qPCR analysis revealed that Exo Ldlr treatment significantly reduced the expression of fibrogenic and inflammatory genes (Figure 5F-H). HE staining of the liver section and other organs further confirmed that exosome treatment did not cause any noticeable toxic effects in these organs (Figure S7).

Exo Ldlr efficiently delivers functional Ldlr ARNm in vitro. A. Schematic illustration of the exosome-mediated Ldlr mRNA delivery into the recipient cells, where the mRNA is translated into the functional protein. B. Fluorescence microscopy images showing the endocytosis of exosomes in the recipient cells. The intracellular distribution of DiI-labeled exosomes was analyzed by fluorescence microscopy. Nuclei were counterstained with Hoechst. PBS served as the negative control. Scale bar=5 μm. C. qPCR analysis of Ldlr mRNA expression in HEK 293T cells treated as indicated. Data are expressed as mean ± SEM of three independent experiments. *, p< 0.05 by one-way ANOVA. D. Western blot analysis of LDLR protein expression in HEK 293T cells treated as indicated. GAPDH served as the loading control. Representative data from three independent experiments.

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In vivo distribution of Exo Ldlr after tail vein injection. A. Representative IVIS images of mice injected with 100 μL PBS, 100 μg (in 100 μL) DiR labeled Exo empty or Exo Ldlr via the tail vein. IVIS imaging was performed 4 h after injection. B. Ex vivo fluorescence imaging analysis of the distribution of the DiR-labeled exosomes in different organs, including the liver, spleen, heart, kidney, and lung. C. Quantification of the fluorescence signal intensity in Fig 3B. n=4, ns, no significance. D. Representative fluorescence microscopic images of the localization of DiI-labeled exosomes. Mice were injected with 100 μL DiI-labeled Exo empty or Exo Ldlr via tail vein and sacrificed 4 h after injection. Scale bar = 20 μm. E. Representative images of localization of the exosomes, immune cells, and the epithelial cells in the liver or lung sections. Scale bar = 10 μm.

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Consistent with the phenotype change in the liver, a striking difference in the appearance of serum was seen after Exo Ldlr treatment. In the control mice receiving PBS treatment, the sera were milky and white. The milky sera were slightly changed after Exo empty treatment. In contrast, the sera were nearly transparent in Exo Ldlr -treated mice (Figure 6B). Similarly, Exo Ldlr treatment dramatically decreased total cholesterol, triglyceride, and LDL-C levels (Figure 6C-E). In contrast, no significant change in HDL-C was observed after Exo Ldlr treatment (Figure 6F). Exo empty treatment also reduced the LDL-C level, though to a much smaller extent (Figure 6E). The LDL-C and HDL-C were examined using chemistry analyzer Chemray-800 and not by FPLC that provides more accurate detection of the lipid distribution.

Given the causal role of non-HDL cholesterol in atherosclerosis, we next examined whether Exo Ldlr treatment had any effect on the progression of atherosclerosis lesions. Treatment of control or Exo Ldlr had no noticeable toxic effects on the liver, lung, kidney, heart, and spleen, as determined by HE staining (Figure S7). Notably, the fatty liver was significantly alleviated after the Exo Ldlr treatment (Figure S7). Besides, fewer and smaller atherosclerosis plaques could be observed in Exo Ldlr -treated mice (Figure 7A-B and S8A). Furthermore, Oil Red O staining of both aortic tree and aortas root showed that the atherosclerotic plaque burden, especially the lipid core, was much less in the Exo Ldlr group than in the control group (Figure 7C-E), which was further confirmed by the cross-sectional view of the aortic roots (Figure 7D-F).

Besides the reduced lipid core, inflammation and collagen content were also examined in the plaques after Exo Ldlr treatment by CD68 immunostaining and Masson's trichrome staining (Figure S8). There were abundant CD68+ cells in the plaques of the control mice, while the macrophage infiltration was dramatically decreased by the Exo Ldlr treatment (Figure S8B and S8D). Notably, no differences were observed in the collagen content between Exo Ldlr -treated and control mice (Figure S8C and S8E).

In summary, we found that LDLR deficiency in Ldlr -/- mice resulted in abnormal lipid metabolism and atherosclerosis. However, exosome-mediated Ldlr mRNA delivery could robustly restore the expression of LDLR and thus reverse the phenotype, such as steatosis, high LDL-C, and atherosclerosis (Figure 8). Our study has provided a new therapeutic approach for the treatment of FH patients. Significantly, it also shed light on the management of atherosclerosis and other genetic diseases associated with liver abnormity.

Exo Ldlr effectively delivers Ldlr mRNA into the liver in vivo. A. Schematic illustration of the experimental procedure. Ldlr -/- mice were fed with a high-fat diet for 8 weeks, followed by the injection of indicated exosomes. L'expression de Ldlr at both mRNA and protein levels in the liver was examined 3 days after injection. B. Semi-quantitative PCR analysis of Ldlr mRNA expression in livers from mice treated as indicated. Lane 1 is DNA ladder. The lower 289 bp band represents the endogenous truncated Ldlr from knockout mice and the 371 bp band represents the exogenous wild-type Ldlr. Data shown are representative of 4 independent experiments. C. Quantitative data of Figure 4B. Data are expressed as mean ± SEM. *, p < 0.05 by one-way ANOVA. D. qPCR analysis of the wild-type Ldlr mRNA in livers from mice treated as indicated. n=4. Data are expressed as mean ± SEM. *, p < 0.05 by one-way ANOVA. E. Western blot analysis of the LDLR expression at the protein level in livers from mice treated as indicated. Notably, there was no endogenous LDLR protein expression in the Ldlr -/- mice with PBS treatment. F. Quantification of Western blot bands by densitometry. Data are expressed as mean ± SEM. *, p < 0.05 by one-way ANOVA.

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Exo Ldlr effectively reduces liver steatosis in Ldlr -/- mice. A. Schematic illustration of the experimental procedure. Ldlr -/- mice were fed with a high-fat diet for 8 weeks, followed by the injection of indicated exosomes once a week for 8 weeks. At the end of the experiment, lipid deposition in the liver and liver function were examined. B. Representative images of Oil Red O staining of the liver samples from indicated groups. C. Percentage of Oil Red O positive area in livers from indicated groups. (D-E) Plasma ALT (D) and AST (E) levels in Ldlr -/- mice treated as indicated. (F-H) qPCR analysis of the expression of Tnfα (F), Mcp1 (G), and Col1a1 (H) in Ldlr -/- mice treated as indicated. Data are expressed as mean ± SEM. *, p < 0.05 by one-way ANOVA. ALT, Alanine aminotransferase AST, Aspartate aminotransferase.

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Exosomes: nanoshuttles to the future of BioMedicine

Exosomes are membrane-bound vesi-cles (50� nm) that are assembled and released by possibly all eukaryotic cells. 1 Their morpho-structural features and specific membrane protein profiles have been exploited to distinguish them from other vesicles. 1 Besides mRNAs, proteins and lipids, exosomes molecular cargoes also comprise non-coding RNAs (ncRNAs) as miRNAs: intercellular transfer of exosomes would determine their horizontal transfer as well. 2 Recently, researchers from Italy, Germany, Sweden reported that in vitro treatment of CRC cells with Cetuximab (an anti-EGFR antibody, which competes with physiological EGFR ligands and blocks downstream proliferative signaling) significantly increased the steady-state asimmetry of miRNAs and proteins distribution between whole CRC cells and their exosomes. 3 Exosomes from untreated CRC cells were highly enriched in miRNAs and proteins involved in blocking proliferation and immune escape: this was confirmed by functional data, which showed decreased proliferation of Caco-2 cells after transfection with exosomes from HCT-116 cells and viceversa ( Fig 1 , left panel). 3 On the contrary, exosomes from Cetuximab-treated CRC cells were enriched in miRNAs and proteins involved in immune response, inflammation activation, cancer progression: in fact, viability of CRC cells increased after incubation with exosomes from treated cells (Fig. 1, left panel). To explain these data, we propose that selection and targeting of exosomal cargo (RNAs and proteins) is performed by a cellular machinery, which is comprised of proteins and ncRNAs regulating their expression activity of this apparatus is regulated by Cetuximab (and possibly other drugs). 3 This Exosomal Cargo Selecting and Transporting Apparatus (ECSTA) could comprise the following components or their functional analogs: (i) proteins from ESCRT (Endosomal Sorting Complex Required for Transport) and others functionally associated, as Alix and TSC101 4 (ii) Rab family members and other proteins involved in membrane trafficking, as GAPs et GEFs 5 (iii) sortilin and functionally associated proteins, as TrkB and EGFR 6 (iv) exosomal RNA-binding proteins (RBPs) 4 (v) miRNAs, long non-coding RNAs (lncRNAs), competing endogenous RNAs (ceRNAs), and other ncRNAs, 7 regulating synthesis, expression and activity of ECSTA protein members. Our data highlight questions that deserve to be experimentally explored. (a) Is Cetuximab-induced asimmetry also observed in vivo in laboratory animals and patients following treatment with Cetuximab ? If so, it should be possible to imagine ways to exploit this phenomenon for clinical therapy and biotechnological applications: for instance, procedures for exosomes removal could be developed and added to traditional drug treatments in CRC patients, when appropriate. (b) Do exosomes carry other ncRNAs, as lncRNAs, circular RNAs (circRNAs), and competing endogenous RNAs (ceRNAs)? (c) Does Cetuximab-induced asimmetry affect them as well? (d) What are the molecular mechanisms through which Cetuximab alters exosomal cargoes? (e) Beyond Cetuximab, are there other molecules capable of producing analogous effects and potentially useful for therapeutic and biotechnological applications? (f) How much does the biomolecular structure of exosomes (membranes and cargoes) depend on the specific phenotype of cells and their physiological state, including ECSTA activity? How much heterogeneous can be structure and cargoes of exosomes synthesized by the same cell type, when exposed to different cues in different biological niches? Incidentally, these 2 latter questions suggest that exosomal cargoes should be exploited with caution for diagnostic purposes. For translational applications, it will be important to improve our knowledge on the mechanics of exosomes interaction with target cells and its biomolecular effects. Exosomes-based drug delivery provides several attractive advantages: (a) low immunogenicity, when self-derived exosomes are used (b) exosomes great stability in blood (c) specific cargoes delivery to target cells (Fig. 1, right panel). RNAs and proteins with therapeutic properties can be engineered to be incorporated into natural exosomes: (1) RNA molecules can be modified by adding short sequence motifs, which would target them to exosomes (2) proteins may be modified by adding domains from known exosomal proteins (e.g., the C1C2 domain of lactadherin). By engineering donor cells to express transmembrane domains of exosomal proteins fused to specific peptides (e.g., ligands of specific membrane receptors), it should be possible to address therapeutic exosomes to specific target cells. Finally, our present knowledge on nanovesicle molecular biology can be effectively exploited for developing artificial exosomes starting by liposomes. Liposome composition (i.e., sphingomyelins, cholesterol, proteins) can be modified ad hoc to mimic exosomal features, which could enhance uptake and delivery of cargo molecules to target cells. Switching to a wider scientific horizon, it will be interesting to verify whether exosomes could be used to horizontally transfer important biologic features among phenotypically different cells from the same organism, the same kingdom, or even across different life kingdoms. A final warning: for the exosome field to hold to the great expectations surrounding it, it will be critically important to homogenize technological methodology and nomenclature.

Exosomes in cancer: biological role and therapeutic applications. (Left panel) Exosomes from CRC cancer cells deliver metastatic signals to other cells and affect immune system. (Right panel) Therapeutic exosomes (both natural and mimetic exosomes) can be loaded with therapeutic molecules and injected into the blood as specific nanovectors of anticancer signals.


Exosome Engineering Approaches

The functional molecule can be either loaded into the lumen or displayed on the surface of exosomes for a therapeutic purpose (Fig. 1a). The two major strategies, including parental cell-based and direct exosome engineering, are routinely employed for loading and displaying functional molecules, and mainly differ in the level of engineering applied for their development. In the parental cell-based approach, the starting material is the cells that are the source of the exosomes, and engineering occurs before exosome isolation from cells. In contrast, in the second approach, exosomes are the direct starting material for engineering, and the engineering procedure occurs after exosome isolation. The next two subsections separately discuss different methods employed in the two main exosome engineering approaches (Fig. 1b).

Parental Cell-Based Exosome Engineering

The parental cell-based approach of exosome engineering, which was first used for discovering the biology of exosomes and not for the purpose of manipulation, consists of genetically engineering cells to produce specifically fabricated exosomes (Fig. 1a). Here, the basics of this approach are discussed via previously published examples, to demonstrate how a functional molecule can be directed to either exosome lumen (loaded) or surface (displayed) using genetic engineering of the parental cells.

Exosomal Surface Display Using Parental Cell-Based Approach

Using the parental cell-based approach of exosome engineering, the most common method for directing a protein to the surface of exosomes uses a exosomal signal peptide. For example, lysosome-associated membrane protein 2b (Lamp2b) is an exosomal surface protein with an exosomal signal peptide. Fusion of a protein of interest to Lamp2b is very common for displaying the protein on the surface of exosomes as a targeting moiety, ligand, or receptor. A Lamp2b-based fusion protein can be used to display rabies viral glycoprotein (RVG), a neuron-specific targeting peptide, on the surface. Expression of Lamp2b-RVG fusion proteins in dendritic cells (DCs) displays RVG on the surface of DC-derived exosomes (Fig. 2a). When these exosomes are systemically administered, surface displayed RVG leads to the accumulation of these exosomes in the neurons and brain of mice [43]. Removal of the signal peptide from Lamp2b-RVG significantly reduces surface display of RVG on the engineered exosomes. Altogether, the signal peptide of Lamp2b can be used to display any fusion protein on the surface of exosomes. In addition, introduction of a glycosylation motif into Lamp2b-RVG fusion proteins could further enhance exosome delivery to the neurons and glial cells by protecting the surface-displayed fusion protein from enzymatic degradation. Therefore, this method allows simultaneous glyco-engineering and display of a protein on the surface of exosomes [52, 53].

Parental cell-based exosome engineering for loading proteins into the lumen of exosomes or displaying them on their surface. une Surface display of a POI using different sorting modules. The fusion protein composed of the POI and the sorting module is directed to the surface of exosomes by an exosomal signal peptide. b Use of WW tag and Ndfip1 for loading Cre enzyme into the exosomes. Ndfip1 recognizes the WW tag and activates the E3 ubiquitin ligases, leading to the ubiquitination of Cre and its subsequent loading into the exosomes. c The EXPLOR method for loading mCherry reporter protein into the exosomes. Blue light-assisted PPI between CRY2 and CIBN results in the formation of a complex between two modules. Sorting of the whole complex into the exosomes is assisted by the CD9 sorting module. After elimination of the blue light, the two parts of the complex separate and mCherry-CRY2 is released to the lumen of exosomes. CRY2 photoreceptor cryptochrome 2, EGFP enhanced green fluorescent protein, EXPLOR exosomes for protein loading via optically reversible protein-protein interactions, Lamp2 lysosome-associated membrane protein 2, mCh mCherry, POI protein of interest, PPI protein–protein interaction, VSVG vesicular stomatitis virus glycoprotein

Other commonly used molecules for exosomal surface display of fusion proteins include tetraspanins (CD63, CD9, CD81) [54], glycosylphosphatidylinositol (GPI) [55], platelet-derived growth factor receptors (PDGFRs) [56], and lactadherin (C1C2 domain) [57]. In a very similar method to Lamp2b fusion proteins, the NH2-terminal of CD63 can be fused to a protein of interest for the same purpose [58].

Other non-cellular and exosomal proteins such as vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVG) have also been used for surface display of proteins on exosomes. VSVG is a key protein involved in virus envelope formation during microdomain budding from the surface of the plasma membrane. Since a similar domain to VSVG participates in the formation of endosomes and exosomes in the cell, researchers used VSVG to express proteins on the exosomal surface. VSVG contains ectoplasmic, transmembrane, and cytoplasmic domains [59]. Replacement of the ecto- and cytoplasmic domains of VSVG with another protein (e.g., green and red fluorescent proteins [GFPs and RFPs] or luciferase), without any alteration in the signal peptide and the transmembrane domain, results in proper exosomal surface display of the protein. Improved protein surface display and improved exosome uptake to the target cells are two advantages of using VSVG fusion proteins for exosomal surface display [60]. The stated methods allow proper display of a protein on the surface of exosomes, while some parental cell-based exosome engineering techniques have been developed recently for loading proteins and RNAs into the lumen of exosomes. These methods are discussed in the next subsection.

Loading Proteins into the Lumen of Exosomes Using Parental Cell-Based Engineering

The loading of therapeutic molecules is a common requirement for the production of therapeutic exosomes. The methods of parental cell-based engineering for loading molecules into the lumen of exosomes were developed very recently. These methods recruit the molecule sorting modules (MSMs) for sorting of proteins and RNAs into the lumen. These modules are able to bind to the protein or RNA of interest and direct them to exosomes. However, different MSMs or other modules have been used in different methods.

Two new methods for loading of proteins into the exosomes mimic the natural protein sorting system of cells based on ubiquitination. In the first method, an engineered ubiquitin tag (the last two glycine residues in the C-terminal are removed) has been developed. Removal of the two glycine residues results in enhanced ubiquitinated protein half-life. Fusion of this ub-tag to the proteins of interest, such as Ag85B and ESAT6 (Mycobacterium tuberculosis proteins) or enhanced green fluorescent protein (EGFP) and nHer2 (tumor antigens), leads to the loading of the proteins into the lumen of exosomes in human embryonic kidney (HEK293) cells. A recent study showed that the ubiquitin tag acts as a sorting sequence, resulting in efficient loading of proteins into exosomes [61]. In the second method, a short tag (WW tag) with the ability to bind specifically to the L-domain motif of Ndfip1 (which activates HECT domain-containing E3 ubiquitin-protein ligases) is used. The WW tag method is another system that uses ubiquitination for the loading of proteins into exosomes. Fusion of Cre recombinase (as a protein of interest) to the WW tag and simultaneous expression with Ndfip1 leads to recognition of the WW tag by Ndfip1 and activation of E3 ubiquitin ligases and ubiquitination of Cre. Subsequently, the ubiquitinated Cre-WW are loaded into the exosomes. Ndfip1 protein induces the molecular switch for ubiquitination and helps with the exosomal packaging of the Cre-WW fusion protein (Fig. 2b). The validation results of the mentioned method showed that when engineered exosomes containing the Cre-WW fusion protein are taken up by the target cells, Cre-WW is capable of DNA recombination [62].

Another method was recently used for the loading of specific proteins into the exosomes by a non-functional mutant of the HIV-I Nef protein. This engineered mutant of Nef (Nef mut ) lacks the enzymatic activity and most functions of the intact Nef protein. The Nef protein is associated with lipid-raft microdomains of the plasma membrane [63] and exosomes. Similar to Lamp2b, CD63, and VSVG fusion proteins, Nef mut is developed for sorting of proteins to the exosomes [64]. Nef mut -GFP fusion protein was successfully loaded into exosomes for monitoring transfection and loading efficiency [65]. Moreover, fusing Nef mut to antigens of several pathogens, including Ebola virus VP24, VP40, and NP, influenza virus NP, Crimean-Congo hemorrhagic fever NP, West Nile virus NS3, and hepatitis C virus NS3, resulted in the expression of stable fusion proteins and their efficient loading into exosomes [66].

A recent attempt to load proteins into the lumen of exosomes was reported by Yim et al. [67]. They employed optically reversible protein–protein interaction (PPI) for the development of EXPLORs (exosomes for protein loading via optically reversible PPIs) using photoreceptor cryptochrome 2 (CRY2) and CIBN PPI modules. This method depends on intracellular delivery of proteins by reversible PPIs and their co-localization into exosomes by irradiation with a blue light. In the first step, a reporter protein was fused to CRY2 and CIBN protein was fused to the exosomal membrane CD9 protein (a representative marker of exosomes) to obtain two fusion proteins (CIBN-EGFP-CD9 and mCherry-CRY2). Blue light induced reversible PPI between CIBN and CRY2 indicates the reporter fusion protein (mCherry-CRY2) direction to the inner surface of exosomes through interaction with CIBN in the CIBN-EGFP-CD9 complex (Fig. 2c). The results of the study showed that protein-loaded EXPLORs increased intracellular levels of reporter proteins in the recipient cells [67].

Loading of RNAs into Exosomes Using Parental Cell-Based Engineering

In addition to the parental cell-based exosome engineering methods and devices developed for loading of proteins into exosomes, similar methods have been developed for loading of RNAs. Recently, a novel parental cell-based strategy was established for loading mRNAs, called the EXOtic (Exosomal Transfer Into Cells) device. In the EXOtic device, in addition to the RNA packaging system (CD63-L7Ae, an archaeal ribosomal protein, which can bind to the C/Dbox in the 3′ untranslated region [UTR] of any RNA structure), two other devices known as cytosolic delivery helper (Cx43 S368A, a mutated connexin 43) and targeting module (RVG-Lamp2b) also contribute, which together provide a new method for loading therapeutic mRNAs into exosomes. Using this device, the mRNA of a catalase enzyme carrying a C/Dbox sequence on its 3′ UTR was loaded into exosomes, which are simultaneously targeted to brain tissue by the Lamp2b-RVG targeting module. Briefly, as we discussed earlier, since CD63 is an exosomal surface protein, the binding of CD63-L7Ae to the C/Dbox of catalase mRNA (through the L7Ae protein) directs the whole complex (CD63-L7Ae-mRNA) to exosomes. This system loads catalase mRNA into exosomes. The validation of this method showed that Lamp2b-RVG on the surface of these exosomes targets them to brain tissue and subsequently reduces neuroinflammation and neurotoxicity in the mouse model of Parkinson’s disease [68]. This is one of the most complex reports on parental cell-based exosome engineering that displays a neuron-targeting protein (RVG) on exosomes and loads a therapeutic mRNA into their lumen simultaneously (Fig. 3a).

Parental cell-based exosome engineering for loading RNAs into the lumen of exosomes. une The different modules of the EXOtic device for loading catalase mRNA into the lumen of exosomes using the CD63-L7Ae sorting module. Connexin is a packaging helper module, and Lamp2b-RVG is a targeting module. b Loading of miR-199a into exosomes using TAT–TAR interaction. Interaction of Lamp2a-TAT as the sorting module with the TAR sequence fused to miR-199a results in the loading of miR-199a into the exosomes. EXOtic EXOsomal Transfer Into Cells, Lamp2 lysosome-associated membrane protein 2, RVG rabies viral glycoprotein, TAR trans-activating response element, TAT trans-activator of transcription

Sutaria et al. [69] designed a system for loading miR-199a into exosomes. They fused a modified miR-199a composed of pre-miR-199a, to a trans-activating response element (TAR) sequence (trans-activation response RNA loop) and separately fused a trans-activator of transcription (TAT) peptide (transcription activator peptide of HIV-1) to Lamp2a (Lamp2a-TAT). When expressed in HEK293 cells, miR-199a-TAR binds to Lamp2a-TAT, and the interaction on the luminal C-terminal of Lamp2a leads to the effective loading of miR-199a into the lumen of exosomes (Fig. 3b). This TAT-TAR protein–RNA interaction strategy can be an efficient tool for loading any therapeutic microRNAs (miRNAs) into exosomes and microvesicles [69].

In this context, using of RNA binding modules seems to be an efficient method for loading RNA into exosomes. Similar to TAT and L7Ae, HuR is an RNA binding protein that binds strongly to miR-155. In this regard, HuR protein was used as an RNA sorting module for exosome engineering. In one study, HuR was fused to the C-terminal of CD9 in order to be localized in the exosomal lumen. Binding to miR-155 and simultaneous localization of the HuR module inside the exosomes results in the loading of miR-155 into the exosomes. HuR can also bind to adenylate uridylate-rich elements of engineered RNAs [70].

Besides the specific loading of molecules into exosomes by means of MSMs, one approach for nonspecific enrichment of exosomes with a molecule is based on the transfection of parental cells with a gene of interest without any other modules for packaging and sorting. Expression of this gene in the cells results in a general enrichment of the molecules in the exosomes. For instance, when cells are transfected with miRNA mimics, after expression of these miRNAs, they are significantly enriched in both MSCs and their derived EVs [9].

Direct or Post-Isolation Exosome Engineering Approach

Small nucleic acid molecules (e.g., miRNAs and short interfering RNAs [siRNAs]) and therapeutic molecules such as anti-cancer drugs can be encapsulated in exosomes by direct exosome engineering. This common type of exosome engineering is technically less complex compared with the parental cell-based methods, and has been widely employed for the application of exosomes as drug delivery or gene delivery vehicles in the last 2 decades. In this approach, common manipulation methods of electroporation [20, 71], extrusion, sonication, incubation, freeze-thaw, bio-conjugation, click chemistry, and cloaking [55, 61] can be used for direct engineering of exosomes after isolation from cells. Given that these methods do not provide a continuous source of engineered exosomes, in contrast to the parental cell-based engineering methods, concise protocols for frequent engineering procedures are warranted for clinical applications. Several informative review articles have been published that describe direct exosome engineering thus, we refer the readers to these reviews for more information [72,73,74]. However, a brief review of these methods is presented here in the next sections and in Table 1.


Are exosomes useful as a transfection or delivery mechanism in gene editing? - La biologie

a NOVA Medical School, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa, 1169-056 Lisboa, Portugal
E-mail: [email protected]

b Centre for Toxicogenomics and Human Health (ToxOmics), Genetics, Oncology and Human Toxicology, NOVA Medical School, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa, 1169-056 Lisboa, Portugal

c Intelligent Polymer Research Institute, ARC Centre of Excellence for Electromaterials Science, AIIM Facility, University of Wollongong, NSW 2522, Australia

d Illawarra Health and Medical Research Institute, University of Wollongong, Wollongong, NSW 2522, Australia

e CNC – Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 3004-517 Coimbra, Portugal
E-mail: [email protected]

f Faculty of Medicine, University of Coimbra, 3030-789 Coimbra, Portugal

Résumé

Neurodegenerative disorders, ischemic brain diseases, and brain tumors are debilitating diseases that severely impact a person's life and could possibly lead to their demise if left untreated. Many of these diseases do not respond to small molecule therapeutics and have no effective long-term therapy. Gene therapy offers the promise of treatment or even a cure for both genetic and acquired brain diseases, mediated by either silencing or editing disease-specific genes. Indeed, in the last 5 years, significant progress has been made in the delivery of non-coding RNAs as well as gene-editing formulations to the brain. Unfortunately, the delivery is a major limiting factor for the success of gene therapies. Both viral and non-viral vectors have been used to deliver genetic information into a target cell, but they have limitations. Viral vectors provide excellent transduction efficiency but are associated with toxic effects and have limited packaging capacity however, non-viral vectors are less toxic and show a high packaging capacity at the price of low transfection efficiency. Herein, we review the progress made in the field of brain gene therapy, particularly in the design of non-toxic and trackable non-viral vectors, capable of controlled release of genes in response to internal/external triggers, and in the delivery of formulations for gene editing. The application of these systems in the context of various brain diseases in pre-clinical and clinical tests will be discussed. Such promising approaches could potentially pave the way for clinical realization of brain gene therapies.


Voir la vidéo: The Science of Exosomes (Août 2022).