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Comment la DO est-elle corrélée avec le nombre de cellules d'algues ?

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Mon équipe de recherche et moi utilisons un spectromètre pour mesurer la DO d'un échantillon d'algues. Nous essayons de répondre à la question « Y a-t-il une corrélation entre la DO et le nombre de cellules d'algues ?

Que devons-nous considérer dans notre expérience? Est-ce une technique établie ?


Comme pour les cellules bactériennes, le nombre de cellules et la DO sont corrélés. Je ne suis pas un spécialiste, mais il semble que vous puissiez utiliser un microscope pour compter visuellement le nombre de cellules, puis le corréler avec la densité optique de la solution que vous avez. Cela vous permettra d'abord d'établir combien de cellules correspondent à 1 unité de DO, puis d'utiliser la DO pour estimer le nombre de cellules plus rapidement qu'en comptant.

Juste quelques détails : le comptage du nombre de cellules se fait en déposant un volume donné de culture sur une lame spéciale avec grille, puis un comptage manuel au microscope.

Si nous supposons qu'une solution à 100 cellules/mL (ou autre) vous donne une DO de 1, alors la DO de 2 correspondra à une concentration de 1000 cellules/mL. Cela est dû à la relation logarithmique entre la DO et l'absorption lumineuse par la culture cellulaire.


Comment la DO est-elle corrélée avec le nombre de cellules d'algues ? - La biologie

Toutes les méthodes ci-dessus nécessitent soit la disponibilité d'équipements coûteux, soit un investissement de temps substantiel. En réalité, la méthode la plus souvent utilisée surveille simplement la densité optique de l'échantillon. L'absorbance de l'échantillon mesurée dans un spectrophotomètre est corrélée soit au poids sec, soit au nombre de cellules par volume.

La concentration de biomasse est l'une des mesures les plus nécessaires dans les études de fermentation. C'est aussi l'un des plus difficiles et peu fiables. Par exemple, toutes les méthodes de poids sec/humide ci-dessus et tout l'équipement de comptage automatisé échouent complètement si le bouillon contient d'autres matières particulaires insolubles, ce qui est souvent le cas dans un fermenteur pratique. De même, la mesure de la densité optique n'a qu'une utilité limitée si le bouillon de fermentation n'est pas limpide. De plus, ces méthodes ne permettent pas de distinguer les cellules viables des cellules mortes. D'autre part, la numération sur plaque standard peut détecter des cellules viables parmi d'autres matières particulaires. Cependant, la méthode nécessite des préparations élaborées, et il faut 24 à 48 heures pour que les cellules soient incubées et comptées, le coût des boîtes de Pétri et des milieux peut également être prohibitif. Par conséquent, le comptage direct sur plaque est inutile dans le contrôle par rétroaction d'un processus de fermentation, il est principalement utilisé industriellement pour contre-vérifier d'autres mesures, en particulier la densité optique.

Dans cette expérience, la densité cellulaire d'un échantillon donné sera mesurée avec les cinq méthodes suivantes : poids humide, poids sec, densité optique, comptage cellulaire direct avec une chambre et dilutions successives suivies d'un placage.


Cycle de vie des laminaires (avec diagramme) | Algues

Cet ordre contient le corps végétal le plus grand et le plus élaboré de toutes les algues. Les membres de cet ordre, mieux connus sous le nom de varech, sont des plantes prédominantes d'eau froide.

À l'exception du genre Chorda, les varechs présentent tous une grande et grossière génération de sporophytes différenciés en crampons, stipe et une ou plusieurs lames. La croissance en longueur résulte d'un méristème intercalaire entre le pied et le limbe qui ajoute du tissu aux deux. La croissance secondaire du diamètre du stipe se produit chez certaines espèces annuelles et chez de nombreuses espèces vivaces.

Les plantes ont une structure interne très développée, montrant une différenciation tissulaire claire. Le sporophyte est la plante évidente, l'histoire de la vie est toujours complétée par un gamétophyte filamenteux microscopique alternatif dont les exigences écologiques sont probablement le plus souvent les facteurs déterminants dans la répartition d'une espèce donnée.

Les sporophytes des Laminariales produisent des sporanges uniloculaires superficiels, soit sur des limbes végétatifs, soit sur des sporophylles spéciales. Les sporanges sont parfois en sores remarquablement définitifs. Ceux-ci mûrissent successivement et tombent du limbe à maturité sous forme de plaque irrégulière, laissant un grand trou qui s'érode rapidement.

Les sporanges sont associés à des paraphyses unicellulaires, toutes deux issues des mêmes cellules basales. La méiose se produit dans les sporanges uniloculaires en développement, qui libèrent généralement 16 à 64 zoospores (32 dans certains cas).

Les zoospores se fixent et forment un mur après une brève mobilité et germent en quelques heures pour se développer en gamétophytes haploïdes. Les gamétophytes, qui se produisent dans un rapport de 1: 1, sont toujours dioïques, et cela a maintenant été déterminé dans un grand nombre d'espèces en culture. L'histoire de la vie des Laminariales a été élaborée pour la première fois par Sauvageau en 1915.

L'aspect général des gamétophytes est remarquablement uniforme dans l'ensemble de la commande. Ce sont tous de petits thalles filamenteux composés de relativement peu de cellules disposées sans distinction. Les plantes mâles ont des cellules plus petites et sont plus abondamment ramifiées que les femelles. Bien que ces gamétophytes aient presque toujours été étudiés en culture, il est possible de les observer dans la nature.

La reproduction sexuée des Laminariales est oogame. Les oogones sont en position terminale ou intercalaire. Chacun forme un seul œuf qui, bien qu'extrudé, reste généralement attaché à l'oogone rompu. Les anthéridies se trouvent à l'extrémité des sons ou sous forme d'excroissances à partir de cellules intercalaires de gamétophytes mâles.

Chacun libère un seul anthérozoïde biflagellé et la plante dégénère après la chute des gamètes. L'œuf fécondé sécrète une paroi et subit bientôt une division pour commencer le développement du sporophyte, mais le gamétophyte femelle persiste pendant les premières phases de cette croissance.

Stipe non ramifié se terminant par une seule lame lame lisse à perforée ou non, avec ou sans côtes, souvent avec des touffes de poils à la surface, la lame peut être en forme d'éventail enroulée en spirale et enroulée à la base.

Les sores sporangiaux sont produits sur les limbes végétatifs et non sur des sporophylles spéciales. Le crampon peut être rhizomateux à discoïde ou conique, généralement le crampon d'un stipe d'haptère ramifié solide ou creux et avec ou sans conduits de mucilage.

Genre Laminaria des Laminariacées :

C'est une algue qui a atteint la plus grande taille formant un élément important de la flore marine pérenne. Il existe de nombreuses espèces de Laminaria, qui ont toutes une très large distribution et sont remarquables dans les eaux froides, tempérées et tropicales. Ils sont populairement connus sous le nom de « tabliers du diable » ? La plupart des espèces préfèrent une eau plus calme.

Pour les industriels, ils sont mieux connus sous le nom de varech et sont généralement utilisés comme source de nourriture, d'iode et d'engrais.

L'algue est caractérisée par un sporophyte bien visible, qui peut mesurer jusqu'à six pieds ou plus de long et se compose d'une base discoïde ou ramifiée, d'un stipe et d'un limbe simple ou digité (Fig. 106A). La croissance se produit au niveau du méristème intercalaire, généralement situé entre le limbe et le stipe (Fig. 106B).

Anatomiquement, le limbe et le stipe peuvent être différenciés en différentes régions, le méristoderme - composé d'une ou plusieurs couches de petites cellules similaires recouvertes extérieurement de mucilage, le cortex externe - des cellules beaucoup plus larges et allongées avec des extrémités pointues, le cortex interne - des cellules plus longues avec extrémités carrées, et la moelle d'une masse de fils emmêlés (Fig. 106C).

Fondamentalement, le limbe présente la même structure que le stipe, seuls les éléments de la région médullaire sont étirés en raison du grand élargissement de la surface. La moelle est caractérisée par la présence de cellules modifiées en structures allongées ressemblant à des hyphes (Fig. 106D), les extrémités transversales de la paroi cellulaire des deux cellules se gonflent pour former des bulbes, dont le bulbe supérieur est toujours plus gros .

La paroi transversale est perforée ressemblant et se comportant comme un tamis. Les hyphes de trompette sont encore des objets de spéculation comme étant suggérés comme étant un tissu de stockage ou conducteur, ou un support. Il existe un système de canaux mucilage anastomosés qui sont particulièrement confinés au stipe.

Le sporophyte porte des taches de zoosporanges uniloculaires et de paraphyses dans les sores sur les deux surfaces du limbe (Fig. 106E & F). Les sporanges se développent successivement en nombre considérable, mûrissant et libérant leur contenu en même temps.

Les zoospores sont formées par la division répétée du noyau sporangial diploïde dont l'un est la méiose, suivie d'un clivage typique du protoplaste du spo­rangium avec production ultime de morceaux uninucléés qui se métamorphosent en zoos­pores. Les zoospores sont biflagellées avec des flagelles inégaux insérés latéralement (Fig. 106G).

Ils produisent, lors de la germination, deux types de gamétophytes de taille microscopique.

Les gamétophytes mâles sont de simples structures filamenteuses à petites cellules ramifiées (Fig. 106H & I). Les anthéridies apparaissent seules ou en groupes au niveau des cellules terminales des fils saillants ou sous forme d'excroissances latérales à partir de la face supérieure des fils rampants et timides.

Chaque anthéridium produit un seul anthérozoïde bi-flagellé inséré latéralement en forme de poire. Le gamétophyte mâle se désintègre après la libération de l'anthérozoïde. Le gamétophyte femelle est une structure filamenteuse peu ramifiée (Fig. 106J), dont n'importe quelle cellule peut fonctionner comme un oogone portant un œuf.

Avant la fécondation, l'œuf sort par une étroite ouverture apicale et reste attaché à la paroi pendant un temps considérable (Fig. 106K).

L'œuf est fécondé par un anéthérozoïde lorsqu'il est déjà attaché à la paroi oogoniale et n'est jamais libéré. Le zygote sécrète une fine membrane et se développe immédiatement en sporophyte sans subir aucune période de repos (fig. 107A à F).

Laminaria présente une alternance hétéromorphe de générations, le sporophyte étant dominant tandis que le gamétophyte est très réduit. La méiose est retardée et a lieu lors de la formation de zoospores dans les zoosporanges. L'ensemble du processus de reproduction sexuée est unique en son genre.

Bien que l'œuf ne soit pas retenu dans l'oogone, il reste attaché à la paroi oogoniale, ce qui indique une étape de transition entre la primitivité et l'avancement. La germination spontanée du zygote lorsqu'il reste déjà attaché au gamétophyte femelle sans aller se reposer est également une caractéristique intéressante du cycle de vie de Laminaria (Fig. 108).

Particularités de Genre Laminaria:

1. Corps végétal sporophytique de taille gigantesque.

2. Le corps de la plante s'est différencié en un crampon, un stipe et un limbe distincts.

3. Remplacement annuel de la lame par la croissance du tissu méristématique situé entre le stipe et la lame.

4. Structure interne complexe du corps végétal sporophytique.

5. Zoosporanges dans les sores se développant sur le limbe.

6. Division de réduction au cours du développement des zoospores dans les zoosporanges.

7. Alternance hétéromorphe des générations.

8. Sporophyte prédominant alternant avec un gamétophyte très réduit.

9. Gamétophytes hétérothalliques.

10. Reproduction sexuée oogame.

11. Fécondation de l'ovule en dehors de l'oogone mais restant attaché à son apex.


Surveillance de la croissance des algues à l'aide de leurs propriétés intrinsèques

Le coût croissant du carburant, ainsi que l'impact du changement climatique, ont considérablement accru l'intérêt pour les sources de carburant alternatives. La production de biocarburants à partir d'algues est un domaine de recherche intense en cours. Un élément clé de cette recherche consiste à surveiller la croissance des algues dans diverses conditions au fil du temps. Nous décrivons ici l'utilisation du lecteur de microplaques multimode Synergy&trade H4 pour surveiller différentes souches d'algues en utilisant soit les propriétés de diffusion de la lumière (turbidité) des algues en solution ou l'excitation de fluorescence de la chlorophylle algale.

Introduction

La croissance d'organismes unicellulaires en culture en suspension peut être surveillée à l'aide de mesures de turbidité ou de diffusion de la lumière. Au fur et à mesure que le nombre de cellules augmente, la solution devient de plus en plus trouble ou trouble car la lumière qui la traverse est diffusée par les micro-organismes présents [1]. Bien qu'il n'obéisse pas à la loi de Beer, à mesure que la diffusion de la lumière augmente, le pourcentage du faisceau lumineux total atteignant le détecteur diminue et est enregistré comme absorbance. La quantification des suspensions cellulaires basée sur la diffusion de la lumière a été décrite pour la première fois par Lord Rayleigh vers 1900. La lumière n'est pas absorbée, mais plutôt les molécules à l'intérieur de la cellule diffractent la lumière incidente. Une grande partie de la lumière diffractée sera déviée du chemin optique vers le détecteur et sera enregistrée en tant que densité optique par le lecteur. Le degré de perte de lumière due à la diffusion de la lumière est influencé à la fois par la particule en suspension, ainsi que par la configuration de l'optique de l'instrument. Les effecteurs spécifiques cellulaires comprennent : la taille des cellules, la composition de la membrane, l'anatomie interne des organites cellulaires et la densité cellulaire. Les dimensions optiques de l'instrument telles que la distance entre le matériau absorbant et le détecteur, la présence ou l'absence de lentilles de focalisation et la taille du faisceau influencent toutes le signal de "diffusion de la lumière". Les organismes photosynthétiques tels que les algues peuvent également être surveillés à l'aide de la chlorophylle. Bien qu'il existe plusieurs structures chlorophylliennes différentes, la chlorophylle a est uniformément répartie entre toutes les espèces végétales. Plusieurs autres formes de chlorophylle ont été trouvées dans les cyanobactéries et les algues qui diffèrent par les chaînes latérales de la structure annulaire centrale. Quel que soit le type, la chlorophylle est une molécule qui peut être détectée par absorbance ou fluorescence. Dans cette note d'application, nous démontrerons l'utilisation efficace de la diffusion de la lumière à 600 nm et de la fluorescence à base de chlorophylle pour surveiller la croissance des algues sans avoir besoin de réactifs ajoutés, en utilisant uniquement les propriétés intrinsèques des cellules.

Matériaux et méthodes

Des cultures de Chlorella vulgaris (2714) et deux isolats différents de souches de Microcystis aeruginosa (LB2238 et LB2061) ont été obtenues auprès de la UTEX Culture Collection of Algae de l'Université du Texas à Austin. Les cellules ont été cultivées dans des milieux BG11, TAP et TP selon les besoins.

Des cultures de cellules d'algues dans des milieux BG11, TAP ou TP ont été cultivées sur une période de plusieurs jours dans des flacons Erlenmeyer stériles de 250 ml. Les cultures en suspension ont été maintenues à température ambiante et agitées à l'aide d'un agitateur rotatif à 100 tr/min avec un éclairage constant. Des aliquotes (200 pL) ont été prélevées et pipetées dans des plaques à fond transparent à parois noires Corning 3603. Les mesures d'absorbance et de fluorescence ont été effectuées à l'aide d'un lecteur de microplaques multimode Synergy H4 (BioTek Instruments, Winooski, VT) en utilisant la fonction de cinétique discontinue [2] du logiciel d'analyse de données Gen5&trade (BioTek Instruments, Winooski, VT) pour gérer les données.

Les courbes d'étalonnage de la diffusion de la lumière et de la fluorescence de chaque type cellulaire ont été produites en diluant en série des cultures cellulaires de densités connues (cellules/mL) qui avaient été déterminées par comptage cellulaire à l'aide d'un hémocytomètre. Les courbes d'étalonnage ont ensuite été interpolées pour fournir des informations concernant le nombre de cellules en utilisant des mesures d'absorbance à 600 nm.

Des balayages spectraux de fluorescence et d'absorbance ont été effectués en utilisant les monochromateurs d'un lecteur de microplaques multimode Synergy&trade H4. L'absorbance des cultures de M. aeruginosa 2061 a été mesurée de 300 nm à 700 nm par incréments de 1 nm et tracée à l'aide du logiciel d'analyse de données Gen5. Les spectres de fluorescence ont également été déterminés en utilisant les mêmes cultures. Le spectre d'émission a été déterminé de 500 nm à 850 nm par incréments de 1 nm en utilisant une longueur d'onde d'excitation fixe de 440 nm. Pour l'analyse spectrale d'excitation, la longueur d'onde d'émission a été fixée à 685 nm et les longueurs d'onde d'excitation variaient de 300 nm à 500 nm par incréments de 1 nm. Les données des deux analyses ont été normalisées à une valeur maximale de 10 000 RFU et tracées à l'aide du logiciel d'analyse de données Gen5&trade (BioTek Instruments).

Résultats

Les balayages spectraux des cultures d'algues démontrent une absorbance significative en dessous de 400 nm ainsi que deux pics d'absorbance distincts à 440 nm et 675 nm (Figure 1). La détermination du nombre de cellules est plus cohérente lorsque la diffusion de la lumière est utilisée plutôt que l'absorbance par les constituants cellulaires. Afin d'éviter l'influence du matériau absorbant, 600 nm a été choisi comme longueur d'onde pour surveiller la croissance.

Figure 1. Courbe spectrale d'absorbance des cultures en suspension de Microcystis aeruginosa.

Les suspensions cellulaires ont été quantifiées à l'aide d'un hémocytomètre et diluées en série. Les mesures d'absorbance, reflétant l'étendue de la diffusion de la lumière par les cellules, lorsqu'elles sont tracées en fonction du nombre de cellules, démontrent une relation linéaire pour les trois lignées cellulaires d'algues testées (figure 2). Des courbes d'étalonnage telles que celles-ci peuvent ensuite être utilisées pour déterminer le nombre de cellules en fonction de la lecture de l'absorbance. Nous avons noté une différence marquée dans la réponse d'absorbance sur une base par cellule avec l'absorbance entre différentes souches et organismes (Figure 2).

Figure 2. Courbe d'étalonnage pour les souches d'algues cultivées en milieu BG11 basée sur la mesure de l'absorbance induite par la diffusion de la lumière.

Des balayages spectraux fluorescents ont également été effectués sur des cultures d'algues. Comme le montre la figure 3, des pics d'excitation et d'émission significatifs ont été observés qui correspondent aux pics attendus pour la fluorescence de la chlorophylle a. Un pic d'excitation a été observé à 434 nm, tandis qu'un pic d'émission à 684 nm a été trouvé. Les déterminations de fluorescence ultérieures ont utilisé une longueur d'onde d'excitation de 440 nm et une longueur d'onde d'émission de 685 nm. Des mesures de fluorescence ont également été effectuées avec des dilutions de cellules d'algues. La réponse fluorescente s'est également avérée linéaire par rapport au nombre de cellules pour les trois espèces d'algues testées (figure 4). L'observation que l'absorbance basée sur la diffusion de la lumière et la fluorescence de la chlorophylle sont toutes deux linéaires et que la réponse des trois souches d'algues avait la même relation suggère que l'une ou l'autre méthode de détermination pourrait être utilisée pour évaluer la croissance cellulaire.

Figure 3. Excitation de fluorescence et analyse spectrale d'émission de cultures en suspension de Microcystis aeruginosa.

Ceci est corroboré lorsque l'on trace la fluorescence à 685 nm (excitation de 440 nm) par rapport à l'absorbance à 600 nm à partir de puits de microplaque individuels de dilutions de Chlorella vulgaris. Une corrélation directe entre les deux mesures est observée avec un coefficient de corrélation élevé (> 0,97) lorsqu'une régression linéaire est effectuée sur un nuage de points (Figure 5).

Figure 4. Courbes d'étalonnage pour les souches d'algues cultivées dans des milieux BG11 basées sur l'excitation de fluorescence de la chlorophylle.

Ces données suggèrent que dans les conditions de croissance d'éclairage à lumière constante utilisées pour ces expériences, des déterminations de la diffusion de la lumière basée sur l'absorbance à 600 nm ou de la chlorophylle basée sur la fluorescence peuvent potentiellement être utilisées pour surveiller la croissance de la culture d'algues en suspension.

Figure 5. Corrélation entre les mesures d'absorbance et de fluorescence des dilutions de Chlorella vulgaris.

Lorsque la croissance de différentes souches d'algues dans le milieu BG11 est comparée en utilisant l'absorbance à 600 nm en conjonction avec la courbe d'étalonnage cellulaire, des différences de souche à souche sont observées (figure 6). Les trois souches présentent des schémas de croissance classiques en forme de sigmoïde.Une phase de latence initiale après l'inoculation où les cellules s'adaptent au nouvel environnement et se développent lentement, qui est suivie d'une phase logarithmique où les cellules se développent et se divisent rapidement et à mesure que les nutriments se raréfient et que les sous-produits métaboliques augmentent, les cellules entrent dans une phase stationnaire .

Comme le montre la figure 6, les aliquotes des trois souches ont augmenté à 600 nm d'absorbance jusqu'à atteindre une phase stationnaire ou de plateau à environ 10 jours. C. vulgaris et M. aeruginosa 2383 ont donné des valeurs d'absorbance très similaires, tandis que M. aeruginosa 2061 plafonne à des densités cellulaires d'environ un tiers des deux autres souches d'algues (figure 6).

Figure 6. Comparaison du nombre de cellules de différentes souches d'algues cultivées dans des milieux BG11.

Lorsque la fluorescence est mesurée dans les mêmes cultures, un schéma de croissance cellulaire différent de celui observé avec l'absorbance est observé. Comme le montre la figure 7, la densité cellulaire des algues vertes C. vulgaris a semblé augmenter rapidement avec peu de preuves d'une phase de latence. M. aeruginosa 2383 a nécessité une période de temps significativement plus longue pour atteindre des niveaux maximaux, tandis que M. aeruginosa 2061 a pris du retard même après 15 jours. Bien que les modèles soient significativement différents, la relation de base entre les trois souches était similaire. Le signal de M. aeruginosa 2061 pour l'absorbance et la fluorescence était significativement inférieur à celui des deux autres souches au bout de 15 jours, tandis que les niveaux maximaux de M. aeruginosa 2383 et de C. vulgaris étaient similaires (Figure 7).

Figure 7. Comparaison de la fluorescence de souches d'algues cultivées dans des milieux BG11.

Lorsque le nombre de cellules et la fluorescence des mêmes cultures sont tracés ensemble et comparés, les différences entre les souches deviennent apparentes. Avec les cultures de C. vulgaris, les augmentations de la chlorophylle mesurées par fluorescence sont étroitement parallèles aux augmentations du nombre de cellules telles qu'interpolées à partir de l'absorbance de 600 nm (figure 8). Cela suggère que la quantité de chlorophylle par cellule reste relativement constante tout au long du cycle de croissance.

Figure 8. Densité cellulaire (à partir des mesures d'absorbance) et Fluorescence de la culture de Chlorella vulgaris en milieu BG11.

Dans les cultures de M. aeruginosa, l'augmentation de la fluorescence a pris du retard par rapport à l'augmentation du nombre de cellules (figure 9). Cela suggère que le nombre de cellules augmente initialement plus rapidement que la quantité de chlorophylle, ce qui entraîne moins de chlorophylle par cellule. Ce n'est que lorsque le changement du taux de nombre de cellules commence à ralentir que le taux d'augmentation de la chlorophyle correspond à celui du nombre de cellules. Finalement, le nombre de cellules et la chlorophylle atteignent un état stable.

Graphique 9. Densité cellulaire (à partir des mesures d'absorbance) et Fluorescence de la culture de Microcystis aeruginosa 2383 en milieu BG11.

Les effets nutritionnels de différentes formulations de milieux peuvent influencer de manière marquée le taux de croissance et la densité cellulaire finale des cultures d'algues. Les cultures de C. vulgaris cultivées dans différentes formulations de milieux, avec des quantités variables de carbone total, ont des densités cellulaires finales nettement différentes telles que mesurées par l'absorbance à 600 nm (figure 10). Les cultures cultivées dans du TAP, qui contient de grandes quantités de carbone, atteignent une densité d'absorbance environ 10 fois supérieure à celle des cultures cultivées dans BG11, qui est pauvre en carbone. Les cultures cultivées dans des milieux TP, qui ont moins de carbone que TAP, ont une densité finale intermédiaire. Fait intéressant, alors que l'absorbance maximale est moindre avec le milieu TP, la croissance en phase logarithmique de C. vulgaris commence plus tôt dans le milieu TP que dans le TAP malgré le fait qu'il ait initialement moins de carbone (Figure 10).

Figure 10. Comparaison des courbes de croissance A600 de Chlorella vulgaris cultivée dans différentes formulations de milieux complets.

La teneur en carbone n'est pas le seul constituant essentiel des milieux de croissance des algues. Les cultures de C. vulgaris cultivées dans des milieux TAP déficients en azote ou en soufre se développent à des vitesses considérablement plus lentes et à des densités finales beaucoup plus faibles (figure 11).

Figure 11. Comparaison des courbes de croissance A600 de Chlorella vulgaris cultivée en milieu TAP complet ou TAP déficient en azote ou en soufre.

Discussion

Ces données démontrent l'utilité de surveiller la croissance des cellules d'algues en utilisant l'absorbance ou la fluorescence. L'évaluation de la densité cellulaire et de l'état de croissance est un élément critique dans la production de biodiesel à base d'algues. L'utilisation de la diffusion de la lumière pour mesurer des objets suspendus, tels que des cellules, est utilisée depuis des décennies. Bien que le plus souvent associé à la croissance des cellules bactériennes, il a également été utilisé pour les cellules de mammifères [1]. Dont la base est la diffraction de la lumière par des fragments en suspension. Un certain nombre de variables affectent la quantité d'absorbance mesurée à partir d'une concentration connue de cellules. La taille, la forme et la structure intérieure des cellules surveillées affecteront la quantité de diffusion de la lumière. La composition physique du chemin optique du lecteur de microplaques influencera également la lecture de l'absorbance lors des mesures de diffusion de la lumière. Les différences de diamètre du faisceau lumineux, de distance focale et de taille de détecteur entre les différents lecteurs rendent difficile la comparaison directe des résultats de diffusion de la lumière.

En tant que tel, pour obtenir les résultats les plus précis, il est nécessaire de générer des courbes d'étalonnage non seulement pour chaque type de cellule algale, mais pour différents types d'instruments. Il existe des différences marquées dans la réponse entre l'absorbance et le nombre de cellules pour différentes souches et espèces d'algues. En tant que telles, les comparaisons doivent utiliser l'utilisation de courbes d'étalonnage pour normaliser les données sur le nombre de cellules. Les comparaisons des résultats au sein de la même espèce peuvent être effectuées sans normalisation sur le nombre de cellules. Toute conversion serait la même pour tous les ensembles de données.

Les constituants des milieux de croissance sont une variable critique pour définir non seulement le taux de croissance, mais aussi la densité cellulaire finale des cultures d'algues. Les formulations de milieux, telles que TAP et TP contenant une teneur en carbone relativement élevée, sont bien mieux à même de soutenir une croissance cellulaire d'algues rapide et dense que les formulations de milieux pauvres en carbone telles que BG11. De même, les conditions de croissance riches en carbone qui manquent d'autres éléments clés tels que l'azote ou le soufre souffrent également d'une mauvaise croissance. Ces restrictions nutritionnelles entraînent souvent une diminution de la synthèse des protéines ou de l'ADN en raison du manque de composants clés de la construction [3].

Les souches de microalgues peuvent avoir des schémas de croissance différents lorsqu'elles sont inoculées à faible concentration. C. vulgaris répond à l'inoculation en augmentant parallèlement le nombre de cellules et la teneur en chlorophylle. Cela suggère que ces cellules maintiennent une quantité constante de chlorophylle par cellule. Les cultures de M. aeruginosa augmentent en nombre de cellules beaucoup plus rapidement que la teneur en chlorophylle, ce qui indique qu'initialement la quantité de chlorophylle par cellule diminue. Ce n'est que lorsque le taux d'augmentation du nombre de cellules ralentit que la quantité de chlorophylle par cellule augmente. Cela suggère que M. aeruginosa utilise des composants de média plutôt que la lumière car il préférait fournir de l'énergie.

La quantification des protéines totales a été utilisée comme moyen de normaliser les réactions cellulaires pendant plusieurs décennies en partant du principe qu'en moyenne, chaque cellule a la même quantité de protéines Contrairement aux cellules animales en culture, la plupart des algues contiennent des quantités importantes de chlorophylle, qui peut facilement être détecté in vivo par sa fluorescence inhérente et peut être utilisé au lieu de mesurer la protéine cellulaire totale. L'utilisation de cette protéine spécifique présente l'avantage marqué d'être non invasive et non destructive. Comme c'est le cas pour les protéines cellulaires totales, les niveaux de chlorophylle cellulaire ne sont pas constants. Les niveaux de chlorophylle peuvent changer non seulement à mesure que les cellules se développent et se divisent, mais aussi en réponse aux changements des niveaux de lumière. Des précautions doivent être prises lors de la comparaison des niveaux de chlorophylle entre des cultures dans différentes conditions de croissance.

Il existe des avantages et des inconvénients à utiliser des mesures basées sur l'absorbance de la diffusion de la lumière ou sur la fluorescence des protéines de la chlorophylle comme moyen de générer des courbes d'étalonnage afin de déterminer le nombre de cellules à partir de cultures expérimentales Les mesures de diffusion de la lumière nécessitent des courbes distinctes pour chaque type de cellule et chaque lecteur différent. Les courbes d'étalonnage ne doivent être réalisées qu'une seule fois ou au plus périodiquement pour identifier la dérive de l'instrument dans le temps. Les valeurs générées pour chaque densité de cellules représenteront une taille de cellule moyenne à partir d'un spectre dans l'échantillon. Comme les mesures d'absorbance ont une unité définie, les comparaisons d'une expérience à l'autre sont faciles à faire. L'étalonnage basé sur la fluorescence est souvent utilisé si l'instrument utilisé n'a qu'un seul mode de lecture et peut fournir une résolution supérieure en termes de changement de signal que l'absorbance, mais souffre d'un certain nombre d'inconvénients. La fluorescence des protéines est une moyenne non seulement de la taille des cellules (les plus grosses cellules auront plus de protéines), mais aussi celle de l'expression cellulaire (certaines cellules ont exprimé plus de protéines). De plus, de nombreux types de cellules d'algues expriment très peu de chlorophylle lorsqu'ils sont cultivés dans un environnement à haute teneur en carbone. De plus, l'absence d'un standard défini pour la fluorescence rend toutes les mesures relatives plutôt qu'absolues. En substance, toute comparaison nécessite une courbe d'étalonnage pour chaque expérience. Ces problèmes ont fait de l'utilisation de la diffusion de la lumière utilisant des mesures de densité optique à 600 nm la méthode préférée pour normaliser et comparer les données expérimentales sur les algues.

Le lecteur de microplaques multimode Synergy&trade H4 est une plate-forme de détection idéale pour surveiller la croissance des cellules d'algues. Le Synergy H4 possède des modules optiques pour l'absorbance, la fluorescence et la luminescence. Les maxima d'absorbance, ainsi que les pics d'excitation et d'émission de fluorescence peuvent être identifiés à l'aide d'une analyse spectrale. La capacité de mesurer à la fois l'absorbance et la fluorescence sur le même échantillon en même temps offre une flexibilité de mesure unique. Le nombre de cellules peut être évalué en utilisant des mesures d'absorbance de diffusion de la lumière à 600 nm ou avec la détection de la chlorophylle par fluorescence. Parce que les deux mesures sont non invasives, les deux peuvent être effectuées sur les mêmes échantillons dans des microplaques. De plus, les microplaques offrent non seulement la possibilité de mesurer des échantillons dans de petits volumes, mais la gamme flexible de densité de puits (6, 12, 24, 48, 96, 384 et 1536) permet au chercheur de choisir la meilleure combinaison de volume de réaction et de numéro d'échantillon pour répondre à leurs besoins. Étant donné que les microplaques ont des géométries définies et acceptées par l'industrie, l'automatisation peut facilement être utilisée pour de nombreuses mesures de routine.


Résultats et discussion

Le choix pour le blanking du spectrophotomètre peut être important

Une considération de base lors de la mesure de la DO d'une culture est de sélectionner un blanc approprié. Selon la nature du travail, il existe trois différents matériaux de blanc couramment utilisés pour les échantillons biologiques : l'eau, les milieux de croissance frais et le surnageant de la culture. Lors de la suppression avec de l'eau, le problème se pose qu'une partie de l'atténuation mesurée sera le résultat des constituants du milieu par opposition aux cellules elles-mêmes. Cependant, la plupart des milieux définis présentent très peu d'atténuation par rapport à l'eau et ce problème est minime. D'autre part, les milieux complexes contenant des hydrolysats de cellules ou de protéines contribuent à l'absorbance dans la plage de 350 à 550 nm. Si un milieu de croissance frais est utilisé comme blanc, la contribution du milieu est incluse, mais des complications surviennent en raison de la contribution fluctuante du milieu à la DO lorsque les cellules commencent à consommer des nutriments. L'approche la plus précise pour corréler la biomasse en suspension consiste sans doute à utiliser le surnageant de culture comme blanc, de sorte que l'atténuation de la lumière mesurée résulte des cellules et que le profil de réflexion multiple de la lumière dans la cuvette se rapproche de celui de l'échantillon. Si l'échantillon doit être dilué avant les mesures de DO, il faut garder à l'esprit la déviation plus rapide de la linéarité due à la diffusion (figure 1B) et une dilution en dessous de la DO≈0,5 est souvent recommandée. Si un milieu autre que le surnageant est utilisé pour la dilution, cela peut être pris en compte et corrigé.

La sélection de la longueur d'onde est critique pour les cellules pigmentées et non pigmentées

Le choix de la longueur d'onde est une considération importante pour surveiller et corréler la densité optique avec la concentration de biomasse [5]. La variation du profil pigmentaire parmi les organismes donne une grande diversité dans les spectres d'absorption, en particulier parmi les souches hautement pigmentées (Figure 5). Une diversité d'apparence d'organismes est illustrée dans le «collage microbien» de la figure supplémentaire (Fichier supplémentaire 1 : Figure S1). Les profils d'absorption des bactéries non pigmentées présentent une absorption décroissante en grande partie de façon monotone à mesure que la longueur d'onde augmente. E. coli des concentrations de cellules en culture ont été rapportées dans la littérature à diverses longueurs d'onde, notamment 420, 460, 590, 600, 650 et 660 nm [5-9]. On peut supposer que puisque E. coli n'est pas pigmenté, le choix de la longueur d'onde n'a pas d'importance. Cependant, comme on peut le voir sur la figure 5, que parmi les bactéries non pigmentées, E. coli a affiché la plus grande variation, diminuant régulièrement de 400 à 1000 nm. Ce déclin se produit lorsque le régime de Rayleigh est approché où la diffusion suit une quatrième puissance inverse avec la longueur d'onde. Cela signifie que la sensibilité diminuera ainsi qu'une augmentation concomitante du poids sec par DO à mesure que des longueurs d'onde plus élevées sont utilisées. Le profil s'avère très cohérent pour un spectrophotomètre donné, ce qui signifie qu'un facteur de correction (δ) peut être appliqué pour convertir entre différentes longueurs d'onde.

L'extrapolation du comportement dépendant de la longueur d'onde obtenu avec différents spectrophotomètres peut conduire à des résultats erronés. Comparaison d'une longueur d'onde de référence typique des algues de 550 nm à une longueur d'onde alternative de 730 nm pour la cyanobactérie Synéchocyste sp. PCC6803 a donné >1 pour un spectrophotomètre mais δ<1 pour un autre (données non présentées). Ceci est un rappel que la lampe et le photocapteur jouent un rôle dans les spectres d'absorption résultants, comme le montre la figure 2.

Les pics dans les spectres d'absorption correspondent aux pigments (tels que la chlorophylle dans les algues Figure 5A) et à l'antenne de récolte de lumière dans les bactéries photosynthétiques violettes Rhodobacter (Figure 5C). La plus grande opportunité d'observer des pics d'absorption pour une énergie plus faible et une lumière de longueur d'onde plus élevée est apparente dans le déclin progressif du spectre d'atténuation à des longueurs d'onde plus élevées qui est particulièrement évident pour les cultures non pigmentées (figure 5B). L'influence du mécanisme d'atténuation de la lumière sur la DO à différentes longueurs d'onde est clarifiée sur la figure 6A. Les pics d'absorbance sont accentués pour les mesures spectrales effectuées à des concentrations cellulaires plus élevées. Bien que cela puisse sembler contre-intuitif sur la base de la saturation des mesures d'absorbance qui se produisent à une densité plus élevée, il faut se rappeler que la mesure réelle est l'atténuation de la lumière. Au fur et à mesure que la concentration de cellules entre la source lumineuse et le capteur augmente, la composante de diffusion de l'atténuation lumineuse totale diminue plus rapidement que la composante d'absorption (Figure 1). À la suite d'événements de diffusion multiples, l'extinction de la lumière due à la diffusion est atténuée par rapport à l'absorption et les hauteurs de pic relatives sont plus élevées (figure 6A). Pour explorer davantage la contribution relative de la diffusion et de l'absorption dans un « spectre d'extinction », les cellules ont été remises en suspension dans des solutions d'albumine de sérum bovin (BSA). En rapprochant l'indice de réfraction de la solution de celui des cellules, la composante de diffusion peut être considérablement réduite, comme le montre la figure 6B, où le pic de chlorophylle de cette culture de chlorella est fortement accentué lorsqu'il est mesuré dans une solution de BSA. Une baisse presque proportionnelle des composantes non pigmentées (diffusion) du spectre est observée pour les complexes photorécepteurs de Rhodobacter capsulatus pour une plage de BSA de 0 à 40 % (Fichier supplémentaire 2 : Figure S2). Cette technique montre la valeur potentielle de la réduction de la diffusion pour observer la pigmentation par exemple dans le criblage basé sur l'absorbance ou la couleur (par exemple les caroténoïdes, les protéines fluorescentes). Cette approche de l'adaptation de l'indice de réfraction peut réduire la diffusion qui domine l'atténuation de la lumière dans les cultures d'algues [10].

Facteurs qui affectent fortement la contribution relative de la diffusion et de l'absorption. UNE) Spectres d'absorption de Chlorelle vulgaire mesurée à trois concentrations non diluées puis normalisée à la densité optique robuste à 550 nm. B) Chlorelle vulgaire spectres mesurés lorsqu'ils sont remis en suspension dans de l'eau du robinet ou de l'albumine de sérum bovin (BSA) à 30 % pour réduire la composante de diffusion de l'atténuation de la lumière.

Il existe deux considérations techniques concurrentes lorsqu'une longueur d'onde pour la mesure de la DO est sélectionnée : sensibilité et robustesse. A une longueur d'onde robuste, la relation entre la DO et la biomasse est largement indépendante des conditions de croissance (DOR = ODRobuste). La cohérence de ces corrélations robustes provient du fait qu'à ces longueurs d'onde, la diffusion de la lumière est relativement peu affectée par les principaux pigments de la cellule. Une longueur d'onde robuste est choisie dans une région du spectre éloignée des pics d'absorption s'ils sont présents. Dans ces régions, le mécanisme d'attention de la lumière est principalement la diffusion qui est relativement constante en raison de la composition cohérente de la biomasse cellulaire et de l'indice de réfraction associé. Pour une culture non pigmentée comme E. coli, pratiquement n'importe quelle longueur d'onde peut être utilisée, mais la DO à 600 nm est devenue une convention courante, en partie en raison de la facilité de génération et de mesure de cette longueur d'onde dans le spectre visible. Certaines limites de la corrélation constante d'une longueur d'onde robuste avec la biomasse sont discutées dans la section « Corrélations avec la biomasse et le nombre de cellules ».

Contrairement à la corrélation de proxy de biomasse relativement constante à des longueurs d'onde robustes, la relation entre la DO et la concentration de biomasse à des longueurs d'onde sensibles peut varier considérablement avec les conditions de culture qui affectent le niveau d'espèces absorbantes telles que les pigments dans la cellule. Étant donné que les « pigments » ont par définition des coefficients d'atténuation importants, de légères fluctuations de la concentration d'un pigment donné peuvent entraîner des changements importants dans la relation entre une DO sensible et la biomasse. Par exemple, les protéines de récolte de lumière de Rhodobacter (Figure 5C) sont complètement absents dans des conditions aérobies et considérablement induits dans des conditions photo-hétérotrophes anaérobies [11]. Pour démontrer la cohérence d'une corrélation de longueur d'onde robuste à la biomasse et la variabilité de la corrélation d'une longueur d'onde sensible à la biomasse, une comparaison a été faite entre des échantillons de Nannochloropsis algue cultivée dans des milieux avec différentes concentrations d'azote. Les cultures cultivées dans des concentrations élevées d'azote ont développé une couleur verte plus foncée que les cultures cultivées dans de faibles concentrations d'azote - qui sont devenues jaune-vert en raison de concentrations considérablement réduites en chlorophylle. Malgré ces différences dans les conditions de croissance, il a été démontré que les corrélations entre le poids sec et la DO robuste à 550 nm étaient presque identiques pour les deux cultures (0,492 g/L/DO550 pour les algues riches en azote versus 0,501 g/L/OD550 pour les algues à faible teneur en azote) (Figure 7). Cependant, la relation entre le poids sec et la DO à 680 nm différait de 34 % (0,325 g/L/DO680 pour les algues riches en azote contre 0,437 g/L/OD680 pour les algues à faible teneur en azote).Le rapport plus faible de la DW à la DO pour les algues vertes à haute teneur en azote indique une concentration plus élevée de chlorophylle, qui absorbe la lumière autour de 680 nm.

Les mesures de DO qui évitent les pics d'absorption fournissent une corrélation robuste de la biomasse. Corrélation entre densité de biomasse et densité optique pour Nannochloropsis cultures d'algues cultivées sur haute et basse teneur en azote pour modifier la teneur en chlorophylle. Mesures correspondant à l'absorbance de la chlorophylle (

680 nm, figure en médaillon) présentent une corrélation très différente par rapport à la corrélation à la longueur d'onde robuste (ODR) de 550 nm.

Malgré le fait que la corrélation entre la biomasse et la DO à une longueur d'onde sensible est sujette à changement avec les conditions, pour des environnements constants tels que la mer, les longueurs d'onde sensibles, telles que 680 nm, sont la longueur d'onde préférée pour estimer les niveaux de phytoplancton. L'utilisation d'une longueur d'onde sensible telle que le pic d'absorption à 680 nm de la chlorophylle, a l'avantage de faciliter la quantification de très faibles concentrations de phytoplancton. De plus, comme le pic de chlorophylle se distingue des autres constituants de l'eau de mer, la teneur en algues peut être différenciée d'une eau simplement trouble. L'observation d'un paramètre de corrélation dépendant de la pigmentation (m??), suggère que les niveaux de pigments peuvent être quantifiés sur la base de rapports entre les longueurs d'onde absorbantes et non absorbantes. Pour corréler la teneur en pigment cellulaire avec les mesures de DO, il faut corriger la mesure de DO à la longueur d'onde absorbante pour sa composante de diffusion. Cette approche est expliquée dans le matériel supplémentaire (Fichier supplémentaire 3 : S3) où le colorant d'exclusion bleu trypan est ajouté quantitativement à E. coli culture pour séparer les composants d'absorption et de diffusion.

La densité optique fournit des facteurs de conversion biologique pour la biomasse et le nombre de cellules

Il existe des considérations supplémentaires au-delà de la « pigmentation » qui affectent la capacité à corréler la densité optique avec la biomasse et les concentrations cellulaires. En général, tout ce qui affecte l'absorption ou la diffusion de la lumière est un candidat potentiel. A titre d'exemple, nous avons observé les algues Botryococcus braunii pour changer la taille des agrégats de la colonie entre 0,09 et 0,34 mm pour différents taux de croissance continue. Ce changement de taille globale est associé à un changement de 2 fois dans le facteur de conversion à la longueur d'onde robuste (mR), reflétant ce grand changement proportionnel de DW/OD550 en raison des grands changements dans la diffusion de la lumière sur cette plage. De plus, certains organismes ont tendance à sécréter des matières telles que des polysaccharides dans diverses conditions qui peuvent altérer de manière significative le spectre d'absorption de la culture. En raison de ces facteurs, il est souvent nécessaire de considérer les variations potentielles d'une corrélation DW/OD lorsque les conditions physiologiques de croissance, <z je> changer considérablement. Il peut être possible de quantifier ce changement avec une mesure de paramètre supplémentaire en fonction de ces conditions, m<z je>:

Malgré les limitations d'utilisation de l'OD, il reste un puissant indice de croissance des micro-organismes en raison de sa simplicité et de sa rapidité. La littérature regorge d'informations sur la croissance et la productivité basées sur ces mesures. En conséquence, les facteurs de conversion biologique entre les quantités de densité optique (DO), de densité cellulaire (gDW/L) et de nombre de cellules (CFU/mL) sont extrêmement utiles. Nous avons répertorié des dizaines de références à ces facteurs de conversion dans la littérature, mais nous sommes réticents à déduire des tendances à partir de ces informations en raison de la complexité des différences entre les spectrophotomètres et les méthodes de gestion des mesures de poids sec et de comptage des cellules. Reconnaissant l'utilité d'une compilation plus cohérente, notre laboratoire a entrepris une étude de ces facteurs de conversion biologique. Ce travail comprenait une gamme variée d'organismes (algues, bactéries, levures) et une gamme de conditions de croissance (hétérotrophes, phototrophes et autotrophes). Notre intention n'était pas simplement de compiler des valeurs moyennes, mais de rapporter des écarts types représentatifs des différents chercheurs responsables de la culture de ce large éventail d'organismes (tableau 1).

Au-delà de fournir une gamme de facteurs de conversion biologique utiles (OD-DW-CFU), de nombreuses observations surprenantes ont été obtenues. Le rapport poids sec/OD robuste (gDW/ODR) variait pour la majorité des organismes entre 0,35 (E. coli) à 0,65 (levure) avec la plupart des algues, cyanobactéries et autres bactéries pigmentées telles que Rhodobacter tombant entre cette plage. Comme indiqué ci-dessus, les algues formant des colonies Botryococcus braunii a un gDW/OD exceptionnellement élevéR en raison de la diffusion vers l'avant de la lumière qui se produit pour les grosses particules. Clostridium phytofermentans avait également un poids sec étonnamment élevé par DO, qui est apparemment dû à l'agglutination ou à la sporulation de cette espèce de bactérie (bien que non macroscopiquement apparent par observation visuelle). L'agrégat de ces données suggère qu'une valeur de 0,5 gDW/ODR est une approximation raisonnable pour la plupart des cultures, ce qui est un peu surprenant étant donné la large gamme d'organismes et les gammes de longueurs d'onde utilisées (550-750 nm). Cette plage relativement étroite de valeurs de corrélation de poids sec (mR), résulte de l'approche générale consistant à utiliser une mesure de longueur d'onde où la diffusion de la lumière domine sur l'absorption spécifique comme mécanisme d'atténuation de la lumière.

Un résultat beaucoup plus surprenant de cette compilation est le facteur de conversion des unités formant colonie par OD robuste (CFU/ODR) variait sur une plage de 2 ordres de grandeur. Bien que le CFU soit intrinsèquement plus difficile à obtenir (et ait une erreur standard plus proche de 25 %) par rapport aux mesures de poids sec (qui présentaient généralement une variation inférieure à 10 %), cela ne tient pas compte de cette énorme gamme de mesures, et illustre la très grande différence dans le nombre de cellules présentes au sein de la culture à densité optique unitaire (DOR =1). Pour les bactéries, une valeur de 1 × 10 9 CFU/OD est souvent citée. Cette valeur est proche de notre valeur de 8,0x10 8 CFU/OD600 pour E. coli, d'autant plus qu'il s'agit du spectrophotomètre Spectramax qui a tendance à lire sur le côté le plus élevé pour la densité optique (figure 4), la valeur pour le spectrophotomètre Beckman le plus courant est égale à cette valeur nominale. Rhodobacter espèces, en particulier capsulé CFU/OD affiché660 > 300 × 10 8 . Pour les conditions de croissance photohétérotrophe anaérobie. En revanche, l'agent de biocontrôle Bacillus thuringensis avait près de 1000 fois moins de bactéries à 0,52x10 8 CFU/OD600, qui contient 10 fois moins de bactéries que E. coli comme cette même longueur d'onde robuste (λR) pour les cellules non pigmentées.

Bien qu'il y ait une tendance pour les plus grandes cellules eucaryotes à avoir de plus petites CFU/OD, Rhodobacter affiche un CFU sensiblement plus élevé que la taille comparable E. coli (0,5 × 2 m) à presque le même poids sec lorsqu'il est mesuré à la même longueur d'onde. C'est une observation intéressante que la lumière traverse une culture photosynthétique de Rhodobacter plus facilement que par exemple un dérivé du sol B. thuringensis. En notant que ce n'est pas au pic d'absorption, cela suggère toujours un plus grand degré de « transparence ». Il est à noter que cette tendance persiste pour différentes conditions de croissance (hétéro-, photo-, auto-trophique) ce qui serait cohérent avec une caractéristique physique des cellules car elles sont si radicalement différentes en pigmentation (Fichier supplémentaire 1 : Figure S1). Fait intéressant, autotrophe Ralstonie, qui n'utilise pas d'énergie lumineuse, n'affiche pas un CFU/OD disproportionnéR. Les diverses « micro-algues » vertes et les cyanobactéries sont étonnamment cohérentes à environ 5x10 7 CFU/ODR qui est comparable à l'espèce de levure. La valeur aberrante extrême de Botryocoque illustre la tendance d'une culture agrégée à permettre la transmission de la lumière et ainsi représenter une masse cellulaire plus élevée pour une densité optique donnée. L'agrégat de ces données ainsi que les différentes longueurs d'onde et spectrophotomètres donnent une idée de la façon dont ce type de facteur de conversion biologique peut être utilisé de manière générale pour fournir des calculs de productivité quantitatifs. La plus grande précision sera obtenue en établissant la corrélation de la biomasse avec le spectrophotomètre spécifique qui sera utilisé lors du suivi. Les estimations fournies par différents spectrophotomètres seraient généralement inférieures à 25 %, bien que l'erreur puisse être plus importante pour des combinaisons de spectrophotomètres spécifiques. Dans de nombreux cas, la concentration absolue de biomasse n'est pas aussi importante qu'une comparaison relative pour les traitements expérimentaux. Cependant, avec la vision accrue des micro-organismes en tant que plateformes de production biochimique pour les produits chimiques et les carburants, il existe des calculs de productivité associés où la différence de 10% est très importante.

Une cellule de débit OD à courte distance de trajet peut être utilisée pour une surveillance en ligne continue

L'une des plus grandes limitations de l'utilisation de l'OD est la saturation (ou plus précisément le manque de sensibilité de la mesure car la quasi-totalité de la lumière s'atténue). En se référant à la loi de Beer-Lambert (équation 1), l'alternative à la dilution d'un échantillon ou à l'utilisation d'une région d'absorbance réduite du spectre est de réduire la longueur du trajet lumineux. Pour obtenir cette réduction de l'épaisseur optique, une cellule d'écoulement OD a été fabriquée en usinant une fente à travers un bloc acrylique (Figure 8). En réduisant la longueur de trajet dans la cellule à écoulement de la longueur de trajet OD standard de 1 cm à environ 0,1, la plage applicable de l'appareil est considérablement étendue. Les détails de fabrication, y compris un dessin mécanique, sont fournis en tant que matériel supplémentaire (Fichier supplémentaire 4 : Figures S3A et B). Une LED utilisée comme source lumineuse a l'avantage d'être une source lumineuse de longue durée peu coûteuse avec une bande passante raisonnablement étroite (bien que réglable uniquement en changeant la LED). Les niveaux de lumière sont détectés avec une photodiode Burr-Brown OPT101P qui est installée dans une fenêtre pour maintenir la puce 8-DIP en place et la concentration de biomasse est mesurée comme l'atténuation de la tension du capteur de photodiode. Cette conception est particulièrement utile pour un spectrophotomètre de surveillance dédié qui peut être mis en œuvre pour une surveillance continue de la croissance. La surveillance OD en ligne réduit non seulement l'échantillonnage manuel, mais permet également une surveillance et un contrôle automatisés des bioprocédés.

Une cellule d'écoulement à densité optique à trajet court pour la surveillance des bioréacteurs. Un spectrophotomètre à cellule d'écoulement usiné à partir d'un bloc acrylique pour accueillir une source de lumière LED d'un côté de la fente d'écoulement de la culture et une photodiode de l'autre. L.T.R. : Vue de face où la photodiode détecte la lumière. E. coli culture.

Le suivi en ligne d'un fed-batch E. coli la fermentation est illustrée à la figure 9. La croissance a été surveillée avec succès jusqu'à une DO600 > 12. À ce stade, la densité de la culture était suffisamment élevée pour que les cellules sédimentent dans la ligne d'écoulement vers et depuis la cellule d'écoulement et l'échec n'était pas dû à la saturation de la mesure de la cellule d'écoulement. Comme le montre l'encadré, les mesures hors ligne non diluées étaient saturées bien avant la DO600 = 1 a été atteint, tandis que les mesures en ligne étaient presque linéaires pour une densité optique supérieure d'un ordre de grandeur. Les efforts en cours améliorent la géométrie et le modèle d'écoulement au sein de la cellule OD, tout en réduisant considérablement les coûts à l'aide du matériel d'interfaçage «open source» Arduino™. Il est important de reconnaître que dans cette application de corrélation de la DO avec la biomasse, il n'est pas nécessaire d'atteindre la linéarité idéale associée à l'équation 2. Tant que la DO ne sature pas et devient indépendante de la concentration cellulaire, une corrélation peut être établie. Ce comportement est illustré dans le fichier supplémentaire 5 : Figure S5 où Chlorelle les cultures à une DO jusqu'à 10 ont été passées à travers la cellule OD. Alors que la courbure est clairement apparente, l'objectif de la biomasse de corrélation peut toujours être atteint en ajustant une équation appropriée qui décrit la saturation du photo-capteur.

Implémentation en ligne de la Flow Cell OD pour surveiller un E. coli fermentation. Mesure de l'évolution temporelle de la DO dans un fed-batch de 5 L E. coli fermentation à l'aide d'une pompe péristaltique pour faire passer la culture à travers la cellule d'écoulement dans une boucle de recirculation. La Flow Cell OD a été implémentée avec une LED de 595 nm (Ligitek, LHY3833, 2700-mcd, 12 o ). La vraie densité optique a été mesurée hors ligne après dilution aux concentrations de biomasse non saturantes sur un spectrophotomètre Beckman. L'encart est un tracé de la corrélation OD-biomasse non diluée mesurée dans la cellule à écoulement par rapport au spectrophotomètre hors ligne.

Où « K » est la concentration cellulaire à demi-saturation de la DOsaturation à laquelle la mesure de la densité optique sature et ne changera pas à des concentrations cellulaires plus élevées.

Cette approche pour ajuster les données de densité optique plutôt que de procéder à une dilution a été publiée comme une brève méthode de recherche où la non-linéarité de la relation entre la vraie concentration cellulaire et la DO peut être capturée à partir du profil de DO de dilution en série d'une culture dense [12]. Cette approche de définition de la densité relative est particulièrement utile pour les évaluations du temps de doublement où les concentrations cellulaires absolues ne sont pas nécessaires. Tant que les mesures sont effectuées dans le même spectrophotomètre, à une longueur d'onde fixe qui reste robuste tout au long de la croissance, l'ajustement est une alternative valable à la dilution. La précision de la corrélation deviendra alors dépendante de la dérivée locale de la mesure (d[X]/dODR), ce qui a tendance à être précis tant que les mesures sont bien en dessous de la saturation. Cela illustre en outre la valeur de notre cellule d'écoulement à courte distance où les calculs mathématiques peuvent être facilement incorporés dans un logiciel qui facilitera l'ajustement de l'étalonnage, puis la sortie de la concentration de biomasse souhaitée pour surveiller la croissance des micro-organismes. Outre les limitations évidentes telles que le changement de pigmentation, il convient de garder à l'esprit que l'atténuation totale de la lumière est la somme des composants de diffusion et d'absorption. Étant donné que ces composants se comportent différemment (figure 1) et que la somme de deux courbes de saturation ne donne pas nécessairement un comportement de saturation simple, des formes fonctionnelles alternatives pour l'équation 5 peuvent être nécessaires pour fournir une corrélation précise entre la densité optique et la concentration de biomasse.


FAITS SUR LE FORAM — ANINTRODUCTION AUX FORAMINIFÈRES

Les individus complètement développés varient en taille d'environ 100 micromètres à près de 20 centimètres de long. Certains entretiennent une relation symbiotique avec les algues, qu'ils « cultivent » à l'intérieur de leur coquille. D'autres espèces mangent des aliments allant des molécules organiques dissoutes, des bactéries, des diatomées et d'autres algues unicellulaires, aux petits animaux tels que les copépodes. Ils attrapent leur nourriture avec un réseau de pseudopodes minces (appelés réticulopodes) qui s'étendent à partir d'une ou plusieurs ouvertures dans la coquille. Les foraminifères benthiques (de fond) utilisent également leurs pseudopodes pour se déplacer.

OÙ VIVENT-ILS?
On estime à 4000 le nombre d'espèces vivant dans les océans du monde aujourd'hui. Parmi celles-ci, 40 espèces sont planctoniques, c'est-à-dire qu'elles flottent dans l'eau. Le reste vit sur ou dans le sable, la boue, les roches et les plantes au fond de l'océan. Les foraminifères se trouvent dans tous les environnements marins, des zones intertidales aux fosses océaniques les plus profondes, et des tropiques aux pôles, mais les espèces de foraminifères peuvent être très particulières quant à l'environnement dans lequel elles vivent. Certaines ne sont abondantes que dans les profondeurs de l'océan, d'autres ne se trouvent que sur les récifs coralliens et d'autres encore ne vivent que dans les estuaires saumâtres ou les marais salés intertidaux.

Les foraminifères sont parmi les organismes à coquille les plus abondants dans de nombreux environnements marins. Un centimètre cube de sédiment peut contenir des centaines d'individus vivants et bien d'autres coquillages morts. Dans certains environnements, leurs coquilles sont une composante importante des sédiments. Par exemple, le sable rose de certaines plages des Bermudes tire une grande partie de sa couleur des coquilles roses à rouges d'un foraminifère. Dans les régions de l'océan profond éloignées de la terre, le fond est souvent presque entièrement constitué de coquilles d'espèces planctoniques.

POURQUOI SONT-ILS IMPORTANTS ?
L'étude des foraminifères fossiles a de nombreuses applications au-delà de l'élargissement de nos connaissances sur la diversité de la vie. Les foraminifères fossiles sont utiles en biostratigraphie, paléoécologie, paléobiogéographie et exploration pétrolière.
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BIOSTRATIGRAPHIE

PALEOECOLOGIE ET ​​PALEOBIOGEOGRAPHIE

La chimie de la coquille est utile car elle reflète la chimie de l'eau dans laquelle elle a grandi. Par exemple, le rapport des isotopes stables de l'oxygène dépend de la température de l'eau, car l'eau plus chaude a tendance à s'évaporer davantage des isotopes plus légers. La mesure des isotopes stables de l'oxygène dans les coquilles de foram planctonique et benthique provenant de centaines de carottes d'eau profonde dans le monde entier a été utilisée pour cartographier les températures passées de l'eau de surface et du fond. Ces données nous aident à comprendre comment le climat et les courants océaniques ont changé dans le passé et pourraient changer à l'avenir.

L'EXPLORATION PÉTROLIÈRE

BIOLOGIE DES FORAMINIFÈRES

CLASSIFICATION DES FORAMINIFÈRES

Les dispositions des chambres que l'on trouve couramment chez les espèces vivantes sont illustrées dans les figures 1-6. Les termes suivants sont utilisés : Uniloculaire fait référence à une coque constituée d'une seule chambre Uniserial fait référence aux chambres ajoutées dans une seule série linéaire Biserial fait référence aux chambres ajoutées dans une double série linéaire Triserial fait référence aux chambres ajoutées dans une triple série linéaire Planispirale fait référence aux chambres ajouté dans une bobine dans un seul plan comme le nautile chambré Trochospiral fait référence à des chambres ajoutées dans une bobine qui forme une flèche comme une coquille d'escargot Milioline fait référence à un arrangement où chaque chambre s'étend sur toute la longueur de la coquille et chaque chambre successive est placée à un angle allant jusqu'à 180 degrés par rapport au précédent, par rapport à l'axe central de la coque. Arborescent fait référence à une série de tubes dressés et ramifiés. Des termes tels que planispiral à bisérial et bisérial à unérial sont utilisés lorsque le mode d'addition de la chambre change au cours de la croissance.

Parmi les divers types de composition de paroi et de microstructure trouvés dans les foraminifères, trois types de base sont communs parmi les espèces vivantes. Les coquilles agglutinées peuvent être composées de très petites particules cimentées ensemble et avoir une surface très lisse, ou peuvent être constituées de particules plus grosses et avoir une surface rugueuse. Les coquilles hyalines sont constituées de microcristaux imbriqués de CaCO3, et ont généralement un aspect vitreux et des pores qui pénètrent dans la paroi. Les parois des coquilles de porcelaine sont composées de cristaux microscopiques en forme de bâtonnets de CaCO3. Ceux-ci ont un aspect laiteux, translucide à opaque et manquent généralement de pores au-delà des chambres initiales. Chez certaines espèces porcines, de petites dépressions dans l'ornementation de surface donnent l'apparence de pores. Un autre type de structure de paroi, appelé microgranulaire, est constitué de grains arrondis équidimensionnels serrés de calcite. Ce type de paroi se trouve dans de nombreux foraminifères paléozoïques, y compris les fusulinides.


Méthodes

Sites d'échantillonnage et collecte

Nous avons collecté des algues eucaryotes à la surface des feuilles de plantes terrestres de manière aléatoire dans le jardin botanique tropical de Xishuangbanna en août 2017. Les échantillons ont été collectés sur 5 sites (Fig. 10 et Fichier supplémentaire 7 : Tableau S1) nous avons collecté 8 échantillons sur chaque site. Chaque échantillon a été prélevé à une distance d'au moins 10 m de tous les autres échantillons. Nous avons sélectionné dix arbres hôtes différents (Mangifera, Artocarpe, Dimocarpe, Ficus, Café, Camélia, Chrysalidocarpe, Caryota, Moussa et Ravenala). Chaque échantillon a été collecté à 2 m au-dessus du sol (nous n'avons donc pas pu observer la surface positive pour nous assurer que toutes les feuilles ont été collectées au hasard) en coupant 2 à 6 feuilles d'une plante individuelle dans des sacs en papier Kraft de différents sites et différents arbres hôtes. Un total de 40 échantillons ont été prélevés dans la présente étude et apportés au laboratoire. Les masses foliicoles observables ont été légèrement grattées sous stéréoscope à l'aide d'un petit scalpel et d'une brosse. Les feuilles dépourvues de couverture algale évidente ont été coupées en petits fragments et secouées dans de petits sacs avec du PBS dilué (Phosphate Buffered Saline, pH = 7,4), puis la masse microbienne a été décortiquée par centrifugation à 6000 xg pendant 10 min. Pour chaque échantillon, une partie de la masse d'algues a été séchée par un lyophilisateur sous vide et conservée à - 80 °C. Les restes des échantillons ont été séchés à l'aide d'une pince à spécimen et déposés dans l'herbier d'algues d'eau douce, Institut d'hydrobiologie, Académie chinoise des sciences, Wuhan.

Carte de 5 sites d'échantillonnage et de 40 sites d'échantillonnage du jardin botanique tropical de Xishuangbanna (La carte a été dessinée par les auteurs sur la base des informations de l'Administration nationale de l'arpentage, de la cartographie et de la géoinformation, http://www.sbsm.gov.cn/). Les sites d'échantillonnage détaillés peuvent être consultés dans le fichier supplémentaire 7 : tableau S1

Extraction, amplification et séquençage d'ADN

L'ADN total de chaque masse environnementale (environ 0,05 g) a été extrait à l'aide du kit Omega ADN végétal supérieur en suivant son manuel. Nous avons utilisé deux couples d'amorces universelles SSU rDNA, NS1F et NS8R, NS1F et 1650R [67] pour amplifier le gène SSU rDNA. Pour les deux couples d'amorces, les profils de cyclage thermique étaient les suivants : 94 °C pendant 5 min, puis 33 cycles de 94 °C pendant 30s, 54 °C pendant 45 s et 72 °C pendant 60s, suivis d'une extension finale à 72°C pendant 6 minutes. Les produits de chaque échantillon ont été mélangés et purifiés avec le kit d'extraction de gel QiaEX (Qiagen, Valencia, CA, USA) et envoyés à Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd. pour le séquençage SMRT par la plateforme Pacbio Squeal. Les produits de chaque échantillon ont été affectés respectivement à un code-barres avant et arrière unique, puis une seule bibliothèque a été construite pour le séquençage. Nous avons utilisé une approche de séquençage de consensus circulaire (CCS). Avec un séquençage consensuel d'au moins trois passes (≥3 CCS), le taux d'erreur moyen était garanti pour diminuer théoriquement à moins de 1,0‰. Toutes les séquences ont été déposées dans le SRA de la base de données NCBI sous le numéro d'accession. SRP14140.

Analyse bioinformatique

Les lectures brutes sans adaptateur ont été attribuées à différents échantillons en fonction des codes-barres (Fichier supplémentaire 8 : Tableau S2). Toutes les séquences jointes avec des bases ambiguës (y compris les séquences avec plus de 5 paires de bases de mésappariement à l'extrémité 5' et avec plus de 8 mêmes paires de bases séquentielles et séquences Chimera) et des longueurs < 1500 pb ont été rejetées par QIIME (Quantitive Insigts Into Micriobial Ecology , v1.8.0) [68]. Des séquences de haute qualité ont été traitées ultérieurement à l'aide de mothur (v. 1.34) conformément aux recommandations de Schloss et al. [69]. Les séquences ont été regroupées en unités taxonomiques opérationnelles (OTU) à un seuil d'identité de 98 %. Les séquences représentatives de chaque OTU ont été annotées par BLASTn, et seules les OTU d'algues eucaryotes ont été traitées en conséquence. Toutes les séquences représentatives ont été attribuées à cinq classes d'algues, à savoir Trebouxiophyceae, Ulvophyceae, Chlorophyceae, Dinophyceae et Eustigmatophyceae. Les OTU avec une abondance inférieure à 0,001% ont été supprimées de la matrice de données de la communauté mais ont été conservées pour l'analyse phylogénétique.

Analyse taxonomique de toutes les OTU

Cinq matrices (Trebouxiophyceae, Ulvophyceae, Chlorophyceae, Dinophyceae et Eustigmatophyceae) ont été construites par des OTU et des séquences provisoires étroitement liées téléchargées à partir de GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Les matrices ont été alignées par mafft 7.3 [70]. Le meilleur modèle pour chaque matrice a été sélectionné à l'aide de Modelfinder selon les critères AIC [71]. Dans la présente étude, nous avons effectué une analyse de vraisemblance maximale par IQ-TREE [72] et utilisé le test SH et la certitude des internodes pour évaluer la topologie de l'arbre de vraisemblance maximale. La méthode UFboot2 a été utilisée pour effectuer des analyses bootstrap sous le modèle best-fit [73]. Pour les cinq analyses UFboot2, le coefficient de corrélation Bootstrap des fréquences d'occurrences fractionnées a été fixé à 0,99. Ensuite, la certitude entre les nœuds a été testée à l'aide d'arbres d'amorçage obtenus à partir d'IQtree dans RaxML [74].

Selon les résultats de l'inférence phylogénétique, nous avons divisé presque toutes les OTU en 11 phylogroupes de niveau d'ordre (nommés comme Apatocoque grouper, Watanabea grouper, CBCE groupe, groupe Prasiolales, groupe Trebouxiales, groupe Microthamnionales, groupe Volvocales, Jenufa groupe, groupe Trentepohliales, groupe Eustigmatales et groupe Gymnodiniales) pour des analyses écologiques ultérieures. Les OTU ont été subdivisées en deux morphotypes, les algues filamenteuses et les algues unicellulaires.

Analyses statistiques

La diversité alpha incluant l'indice de Shannon-Wiener et l'indice de diversité de Simpson ont été calculées pour chaque échantillon à l'aide du logiciel QIIME. L'analyse de Venn a été réalisée dans le package Venndiagram [75] dans la version R 3.2 [76]. Une analyse de variance bidirectionnelle (ANOVA) a été réalisée pour tester les effets des arbres hôtes et des sites d'échantillonnage sur la diversité alpha (nombre d'OTU, indice de Shannon-Wiener et indice de Simpson) et les abondances relatives des différents taxons d'algues. L'ANOVA a été réalisée à l'aide du package SPSS 18.0 (SPSS, USA), avec un p-valeur < 0,05 sélectionné pour la signification. Les données d'origine ont été normalisées à l'aide de la normalisation avant l'analyse statistique et ANOSIM (Analyse des similitudes), SIMPROF (Analyse de profil de similitude) et NMDS (Échelle multidimensionnelle non paramétrique) ont été réalisées à l'aide de Primer 6.0 [77]. La ressemblance de la matrice de données a été mesurée par la dissimilarité de Bray-Curtis.


Autres organites liés à la membrane

Les mitochondries sont des organites à double membrane de forme ovale qui ont leurs propres ribosomes et ADN. Ces organites sont souvent appelés les "usines énergétiques" d'une cellule car ils sont responsables de la fabrication de l'adénosine triphosphate (ATP), la principale molécule porteuse d'énergie de la cellule, en conduisant la respiration cellulaire. Le réticulum endoplasmique modifie les protéines et synthétise les lipides, tandis que l'appareil de Golgi est l'endroit où ont lieu le tri, le marquage, l'emballage et la distribution des lipides et des protéines. Les peroxysomes sont de petits organites ronds entourés de membranes simples, ils effectuent des réactions d'oxydation qui décomposent les acides gras et les acides aminés. Les peroxysomes détoxifient également de nombreux poisons qui peuvent pénétrer dans le corps. Les vésicules et les vacuoles sont des sacs liés à la membrane qui fonctionnent dans le stockage et le transport. Outre le fait que les vacuoles sont un peu plus grandes que les vésicules, il existe une distinction très subtile entre elles : les membranes des vésicules peuvent fusionner avec la membrane plasmique ou d'autres systèmes membranaires à l'intérieur de la cellule. Tous ces organites se trouvent dans chaque cellule eucaryote.


Quelles sont les causes des proliférations d'algues?

Le développement et la prolifération des proliférations d'algues résultent probablement d'une combinaison de facteurs environnementaux, notamment les éléments nutritifs disponibles, la température, la lumière du soleil, la perturbation de l'écosystème (conditions stables/de mélange, turbidité), l'hydrologie (débit de la rivière et niveaux de stockage de l'eau) et la chimie de l'eau (pH, conductivité, salinité, disponibilité du carbone…).

Cependant, la combinaison de facteurs qui déclenchent et entretiennent une prolifération d'algues n'est pas bien comprise à l'heure actuelle et il n'est pas possible d'attribuer les proliférations d'algues à un facteur spécifique. EN SAVOIR PLUS sur les facteurs qui causent la prolifération d'algues.

Les nutriments favorisent et soutiennent la croissance des algues et des cyanobactéries. L'eutrophisation (enrichissement en nutriments) des cours d'eau est considérée comme un facteur majeur. Les principaux nutriments contribuant à l'eutrophisation sont le phosphore et l'azote.

Dans le paysage, le ruissellement et l'érosion des sols provenant des zones agricoles et des pelouses fertilisées, l'érosion des berges et des lits des rivières, le défrichement (déforestation) et les effluents d'eaux usées sont les principales sources de phosphore et d'azote entrant dans les cours d'eau. Tous ces éléments sont considérés comme des sources externes.

L'origine interne des nutriments provient des sédiments du lac/réservoir. Le phosphate s'attache aux sédiments. Lorsque la concentration en oxygène dissous est faible dans l'eau (anoxique), les sédiments libèrent du phosphate dans la colonne d'eau. Ce phénomène favorise la croissance des algues.

Les premières proliférations d'algues bleu-vert se développent généralement au printemps, lorsque la température de l'eau est plus élevée et que la lumière est accrue. La croissance est soutenue pendant les mois les plus chauds de l'année. Les températures de l'eau supérieures à 25°C sont optimales pour la croissance des cyanobactéries. A ces températures, les algues bleu-vert ont un avantage compétitif sur les autres types d'algues dont la température optimale de croissance est plus basse (12-15°C).

Dans les régions tempérées, les proliférations d'algues bleu-vert ne persistent généralement pas pendant les mois d'hiver en raison des basses températures de l'eau. Les températures de l'eau plus élevées dans les régions tropicales peuvent entraîner la persistance de proliférations d'algues bleu-vert tout au long de l'année.

Les populations d'algues bleu-vert diminuent lorsqu'elles sont exposées à de longues périodes de forte intensité lumineuse (photo-inhibition) mais ont une croissance optimale lorsqu'elles sont exposées par intermittence à de fortes intensités lumineuses. Ces conditions sont réunies sous la surface de l'eau où l'environnement lumineux est fluctuant.

Même dans des conditions de faible luminosité ou dans des eaux troubles, les algues bleu-vert ont des taux de croissance plus élevés que tout autre groupe d'algues. Cette capacité à s'adapter à des conditions lumineuses variables donne aux cyanobactéries un avantage concurrentiel sur les autres espèces d'algues.

La plupart des algues bleu-vert préfèrent des conditions d'eau stables avec de faibles débits, de longs temps de rétention, des vents légers et une turbulence minimale, d'autres préfèrent des conditions de mélange et des environnements turbides.

La sécheresse, l'extraction d'eau pour l'irrigation, la consommation humaine et animale et la régulation des rivières par les déversoirs et les barrages contribuent tous à la diminution des débits d'eau dans nos systèmes fluviaux. L'eau se déplace plus lentement ou s'accumule, ce qui favorise la croissance des algues.

Dans les plans d'eau, une autre conséquence des conditions stables est la stratification thermique. La stratification thermique se produit lorsque la couche supérieure de la colonne d'eau devient plus chaude et que la couche inférieure reste plus froide. Lorsque les deux couches cessent de se mélanger, la couche supérieure devient plus stable (pas de mélange induit par le vent, cellules de convection) et les proliférations estivales d'algues bleu-vert flottantes sont soutenues.

Lorsqu'un plan d'eau est stratifié, les eaux de fond s'appauvrissent souvent en oxygène (anoxie), ce qui peut entraîner une augmentation de la libération de nutriments par les sédiments. Les impulsions de nutriments de la couche inférieure plus froide peuvent alimenter la croissance des algues dans la couche supérieure.

La turbidité est causée par la présence de particules en suspension et de matière organique (flocons) dans la colonne d'eau. Une turbidité élevée se produit lorsqu'une grande quantité d'eau s'écoule dans le système (débit élevé après un événement pluvieux). Une faible turbidité se produit lorsqu'il n'y a qu'une petite quantité de matières en suspension dans la colonne d'eau. Une faible turbidité peut être due à un mouvement lent ou à une eau stagnante qui permet aux articles en suspension de se déposer hors de la colonne d'eau. Lorsque la turbidité est faible, plus de lumière peut pénétrer à travers la colonne d'eau. Cela crée des conditions optimales pour la croissance des algues. En retour, la croissance des algues crée un environnement trouble.


Reproduction sexuelle : 3 étapes du cycle de reproduction sexuelle

Ces événements peuvent être regroupés en trois étapes : les événements de pré-fécondation, de fécondation et de post-fécondation.

1. Événements de pré-fertilisation :

Ces événements de reproduction sexuée sont antérieurs à la fusion (fécondation) des gamètes mâles et femelles.

Image courtoisie : obgyn.med.umich.edu/sites/obgyn.med.umich.edu/files/pregnantbelly_crop-1024𴫫.jpg

Ces événements sont la gamétogenèse et le transfert de gamètes.

(i) Gamétogenèse (Gk. gametos = gamète, genèse = production) :

Le processus de formation de deux types de gamètes, mâle et femelle, est appelé gamétogenèse. Les gamètes sont des cellules haploïdes. Chez certaines algues, les deux gamètes sont si similaires en apparence qu'ils sont appelés homogamètes (isogamètes Fig. 1.29), par exemple, Cladophora, Ulothrix. Par conséquent, il n'est pas possible de les différencier en gamètes mâles et femelles.

Cependant, dans la plupart des organismes à reproduction sexuée, les gamètes sont de deux types morphologiquement différents, ils sont donc appelés hétérogamètes (anisogamètes), par exemple Fucus (une algue brune), les humains. Dans ces organismes, le gamète mâle est appelé anthérozoïde ou spermatozoïde et le gamète femelle est connu sous le nom d'œuf ou d'ovule (Fig. 1.29 B.C).

Division cellulaire pendant la formation des gamètes :

Les gamètes sont haploïdes, que les structures ou les cellules qui les produisent soient haploïdes ou diploïdes. La structure formée par la fusion des gamètes est toujours diploïde. Elle est due à la méiose qui se produit dans la vie de tous les organismes se reproduisant sexuellement. Les cellules productrices de gamètes qui subissent une méiose sont appelées méiocytes (cellules mères des gamètes). Ces derniers sont diploïdes. Sur la base du stade auquel la méiose se produit, la méiose est de trois types.

La méiose se produit dans les organismes haploïdes producteurs de zygotes. Ainsi, le zygote fonctionne comme un méiocyte. Exemples : Chlamydomonas et Ulothrix.

La méiose se produit à l'intérieur des sporanges. Les méiocytes se produisent à l'intérieur des sporanges produisant des spores haploïdes. Lors de la germination, les spores haploïdes (méiospores) produisent des corps haploïdes appelés gamétophytes. Les gamètes sont produits dans les gamétophytes par mitose. Exemples : la plupart des plantes.

Les cellules germinales sont diploïdes et agissent comme des méiocytes, qui subissent une méiose pour produire des gamètes haploïdes. Exemples : la plupart des animaux. Ainsi, les méiocytes ont un nombre diploïde (2N) de chromosomes et les gamètes contiennent un nombre haploïde (N) de chromosomes.

Nombres de chromosomes dans les méiocytes (diploïdes, 2N) et les gamètes (haploïdes, N) de certains organismes.

Nom de l'organisme Nombre de chromosomes dans le méiocyte (2n) Nombre de chromosomes dans le gamète (N)
Êtres humains 46 23
Mouche domestique 12 6
Rat 42 21
Chien 78 39
Chat 38 19
Mouche des fruits (drosophile) 8 4
l'éléphant 56 28
Pomme 34 17
Riz 24 12
Maïs 20 10
Pomme de terre 48 24
Papillon 380 190
Oignon 32 16
Ophioglossum (une fougère) 1260 630

Après la formation des gamètes mâles et femelles, ils doivent être réunis pour la fécondation. Dans la plupart des organismes, le gamète mâle est mobile et le gamète femelle est immobile. Cependant, il existe quelques champignons et algues où les deux types de gamètes sont mobiles (Fig. 1.30).

Un milieu est nécessaire à travers lequel les gamètes mâles se déplacent. Chez les algues, les bryophytes et les ptériodophytes, l'eau sert de milieu à travers lequel le transfert des gamètes a lieu. Étant donné que plusieurs gamètes mâles n'atteignent pas les gamètes femelles, les gamètes mâles sont donc produits en grand nombre, c'est-à-dire plusieurs milliers de fois plus que les gamètes femelles.

Chez les plantes à fleurs, les grains de pollen portent les gamètes mâles qui sont produits en grand nombre. Les grains de pollen sont transférés au stigmate de l'organe femelle (carpelle) par le processus de pollinisation. Le transfert des grains de pollen de l'anthère au stigmate est appelé pollinisation.

La pollinisation est de deux types : l'autopollinisation et la pollinisation croisée. L'autopollinisation est le transfert des grains de pollen de l'anthère d'une fleur au stigmate de la même fleur ou au stigmate d'une autre fleur de la même plante ou d'une plante génétiquement similaire. La pollinisation croisée est le transfert de grains de pollen de l'anthère d'une fleur au stigmate d'une fleur génétiquement différente d'une autre plante de la même espèce.

Chez les animaux unisexués, les gamètes mâles et femelles se forment chez des individus différents, par conséquent, l'organisme doit développer un mécanisme spécial pour le transfert des gamètes. De nombreux animaux ont des organes copulateurs pour transférer les gamètes mâles. Le transfert des gamètes et la réunion des gamètes sont essentiels pour la fécondation dans la reproduction sexuée.

2. Fécondation :

La fécondation est la fusion complète et définitive de deux gamètes de parents différents ou du même parent pour former un zygote diploïde. Ce processus est également appelé syngamie. Bien que les termes syngamie et fécondation soient fréquemment utilisés de manière interchangeable. Si la syngamie ne se produit pas, il n'y aurait pas de variations dans la progéniture.

Où se produit la fécondation ?

La fécondation se fait soit en milieu extérieur (eau) soit à l'intérieur du corps de l'organisme. Ainsi, il existe deux types de fusion gamétique à savoir la fécondation externe et la fécondation interne.

(i) Fertilisation externe :

Lorsque la fécondation se produit en dehors du corps de l'organisme, ce type de fusion gamétique est appelé fécondation externe ou syngamie externe. Le milieu extérieur tel que l'eau est nécessaire pour ce type de fertilisation. Ainsi, dans la plupart des organismes aquatiques tels que la majorité des algues, des poissons et des amphibiens, une fertilisation externe se produit.

Les organismes présentant une fertilisation externe produisent un grand nombre de gamètes dans l'eau pour augmenter les chances de fertilisation. Cela se produit chez les poissons osseux et les grenouilles où un grand nombre de descendants sont produits. Un inconvénient majeur de ce type de fécondation est que la progéniture n'est pas protégée des prédateurs et que sa survie est menacée jusqu'à l'âge adulte.

(ii) Fertilisation interne :

Lorsque l'œuf se forme à l'intérieur du corps féminin où il fusionne avec le gamète mâle, le processus est appelé fécondation interne ou syngamie interne. De nombreux organismes terrestres appartenant à des champignons, des animaux supérieurs tels que des reptiles, des oiseaux et des mammifères et la majorité des bryophytes, des ptéridophytes, des gymnospermes et des angiospermes sont des exemples de fécondation interne.

Ici, le gamète mâle est mobile et doit atteindre l'œuf pour fusionner avec lui. Le nombre de spermatozoïdes produits est très important mais il y a une réduction du nombre d'ovules produits. Cependant, dans les plantes à graines, les gamètes mâles non mobiles sont transportés vers le gamète femelle par les tubes polliniques.

3. Événements post-fécondation :

Les événements de la reproduction sexuée après la fécondation (formation de zygote) sont appelés événements post-fécondation. Ces événements peuvent être décrits sous deux rubriques : zygote et embryogenèse.

(i) Zygote :

Après la fécondation, un zygote diploïde se forme chez tous les organismes à reproduction sexuée. En fécondation externe, le zygote se forme dans le milieu externe (généralement de l'eau) alors qu'en fécondation interne, le zygote se forme à l'intérieur du corps de l'organisme. Le développement ultérieur du zygote dépend du type de cycle de vie de l'organisme et des conditions environnementales.

(a) Dans de nombreux champignons et algues, le zygote développe une paroi épaisse et forme une spore appelée zygospore. Zygospore subit une période de repos. Il germe au cours de la prochaine saison de croissance. La zygospore subit une méiose pour produire des individus haploïdes. Il mène un cycle de vie haploïde.

(b) Chez la plupart des animaux, le zygote ne se repose pas. Il se divise par mitose formant d'abord un embryon diploïde puis l'individu qui est également diploïde.Il mène un cycle de vie diplontique.

(c) Dans la plupart des plantes, le zygote forme d'abord un embryon, puis le sporophyte diploïde. Le sporophyte a des sporanges où la méiose a lieu pour former des spores haploïdes. Ces derniers produisent des gamétophytes haploïdes. Les gamètes sont produits dans les gamétophytes. Il mène un cycle de vie diplohaplontique.

(ii) Embryogenèse :

Le processus de développement de l'embryon à partir du zygote est appelé embryogenèse. Au cours de l'embryogenèse, le zygote subit une division cellulaire mitotique et une différenciation cellulaire. La division cellulaire augmente le nombre de cellules dans l'embryon en développement, tandis que la différenciation cellulaire aide à former des tissus et des organes spécialisés pour former un organisme.

(i) Sur la base du développement du zygote, les animaux sont regroupés en ovipares, vivipares et ovovivipares. Les animaux ovipares tels que les reptiles et les oiseaux pondent des œufs. Leurs œufs fécondés sont recouverts d'une coquille calcaire dure et sont pondus dans un endroit sûr dans l'environnement. Après la période d'incubation, les jeunes éclosent. Chez les animaux vivipares tels que la majorité des mammifères, y compris les êtres humains, le zygote se développe en un jeune à l'intérieur du corps de l'individu femelle.

Après une certaine croissance, les jeunes sont livrés par l'individu femelle. En raison de soins et d'une protection appropriés, les chances de survie des jeunes sont plus élevées chez les individus vivipares. Chez les animaux ovovivipares, la femelle retient les œufs à l'intérieur de son corps après la fécondation et permet le développement de l'embryon à l'intérieur du corps sans fournir de nourriture supplémentaire à l'embryon en développement car le placenta est absent. Cependant, les femelles donnent naissance aux petits. Des exemples d'animaux ovovivipares sont les requins et les serpents à sonnettes.

(ii) Chez les plantes à fleurs, le zygote se forme à l'intérieur de l'ovule des organes sexuels femelles. Après la fécondation, les sépales, pétales et étamines de la fleur se fanent et tombent. Les sépales restent attachés chez Hibiscus. Cependant, le pistal reste attaché à la plante.

Formation de graines et de fruits :

Chez les angiospermes, la double fécondation produit deux structures : un zygote diploïde (= oospore) et une cellule d'endosperme primaire triploïde. Le zygote forme l'embryon. La cellule primaire triploïde de l'endosperme donne naissance à un tissu nutritif appelé endosperme. L'endosperme fournit de la nourriture à l'embryon en croissance. Les ovules fécondés mûrissent et se transforment en graines. La paroi de l'ovaire forme le péricarpe (paroi du fruit). L'ovaire mûr avec péricarpe et graines est appelé fruit. Le péricarpe protège les jeunes graines. Après dispersion, les graines germent pour former de nouvelles plantes.

Maintien du nombre de chromosomes :

Les unités de reproduction dans la reproduction sexuée sont les gamètes mâles et femelles produits respectivement par les testicules et les ovaires. Les gamètes sont haploïdes avec seulement N chromosomes. Par conséquent, le zygote résultant de la fusion de deux de ces gamètes haploïdes devient diploïde avec 2N chromosomes. La progéniture qui se développe à partir du zygote est également diploïde.