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Qu'est-ce qui cause mon problème avec des rendements très faibles lors de l'isolement d'un plasmide de levure de 42 kb ?

Qu'est-ce qui cause mon problème avec des rendements très faibles lors de l'isolement d'un plasmide de levure de 42 kb ?



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Je dois isoler un gros plasmide de levure et le transformer en E. coli. Après transformation, je n'obtiens souvent aucune colonie. L'une des raisons à cela est que la mini préparation de levure n'a pas fonctionné ou que la concentration d'ADN est trop faible. J'ai essayé deux protocoles d'isolement différents :

  • Kit de préparation de plasmide de levure Zymoprep I

    Extrait de la doc : "basé sur l'ancienne méthode de lyse alcaline d'E. coli avec notre Zymolyase ajoutée dans la première solution."

  • Protocole d'isolement phénol chloroforme YAC

    utilisé par Dan Gibson et. al] pour leurs énormes constructions (>100kb)

    Ils utilisent une colonne Qiagen grande construction coûteuse à la fin, afin de purifier et de visualiser l'extrait de levure sur un gel, mais je saute cette étape car la colonne Qiagen coûte 40 $ par clone de levure, ce qui ne s'adapte pas si nous faisons beaucoup de ces.

Comment puis-je dépanner et optimiser les protocoles mentionnés ci-dessus ? Existe-t-il d'autres protocoles qui pourraient être plus adaptés à un grand plasmide et n'utilisent pas de matériaux trop coûteux ?


Un protocole fiable pour l'extraction d'ADN de levure que j'avais l'habitude d'utiliser était largement similaire aux protocoles que vous citez, mais comprenait une précipitation à l'éthanol avant et après les extractions P:C. Le seul matériau coûteux était le temps. Le schéma général était le suivant :

  1. Lyse alcaline
  2. Précipitation d'éthanol
  3. Traitement à la RNase A de l'ADN remis en suspension pendant 15 minutes
  4. Extraction au phénol:chloroforme (x2)
  5. Précipitation d'éthanol

Vous savez probablement que la tradition des précipitations à l'éthanol est que le rendement est meilleur plus vous faites vos précipitations à l'éthanol longtemps et à froid. Je n'ai jamais fait de réactions de transcriptase inverse que quelques fois, mais la matrice d'ADN que j'ai préparée a passé la nuit dans de l'éthanol à -80C pour maximiser le rendement. Un autre endroit à vérifier est que vos cultures de levure sont suffisamment denses avant de commencer.


J'ai utilisé avec succès le kit Zymoprep, mais uniquement pour des plasmides plus petits dans des expériences 2-hybrides. Donc, leur système d'enzyme/tampon de lyse cellulaire fonctionne bien, mais je suppose que votre plasmide de 42 kb précipite avec l'ADN génomique.

Les colonnes midi Qiagen standard sont capables de capturer de grandes constructions. Cela a fait des merveilles pour moi lorsque je purifiais de gros BACmids d'E. coli - et a réduit le coût à 10 $/échantillon (cela nécessite un tampon supplémentaire, mais c'est une dépense mineure). Cela pourrait valoir la peine d'essayer les protocoles d'ADN de levure Qiagen pour le kit midi et de voir si vous pouvez isoler votre grand plasmide ?


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